周波组与邹卫国组利用谱系示踪和单细胞转录组解析骨折修复全过程

　　

3月29日，国际学术期刊Developmental Cell在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周波研究组和邹卫国研究组的合作研究成果：“Fibrous periosteum repairs bone fracture and maintains the healed bone throughout mouse adulthood”。该项工作揭示了小鼠骨外膜中被认为不拥有成骨能力的骨外膜纤维层细胞虽然在稳态下不参与成骨，但在骨折后是损伤修复最主要的贡献者。研究同时发现骨折前后负责成骨的骨骼干细胞发生转变，也为提高愈合骨的骨质量指明了方向。

骨骼干细胞（skeletal stem cells）作为一类多能干细胞，具有自我更新和向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞三系分化的能力。它在骨骼的发育，稳态维持与损伤修复过程中发挥着重要作用。骨骼干细胞的功能损伤会严重影响骨骼的发育和损伤修复进程。在骨折后愈合困难（骨不连）的治疗中，骨骼干细胞的移植被认为是最有潜力的治疗方案。但骨骼干细胞存在高度异质性，广泛存在于骨髓、生长板和骨外膜处。既往的研究显示多种异质性的骨骼干细胞都参与了骨折损伤修复进程。然而由于研究手段的限制，这些研究中人们通常将骨外膜当作一个整体进行研究，忽略其内部存在的异质性。

周波和邹卫国研究组一直致力于骨骼干细胞的谱系研究。在最近的这项工作中，他们构建了一个全新的双同源重组酶报告基因R26^ZT1,并筛选了多种能标记骨骼干细胞的谱系示踪小鼠，从而建立一套可同步示踪两类异质的骨骼干细胞同步示踪系统（SSC-Simultracer）。此系统可以利用tdTomato和ZsGreen荧光蛋白的表达区分骨髓（BMSC）、骨外膜生发层（CL-PC）与骨外膜纤维层（FL-PC）中的骨骼干细胞的谱系命运。

研究团队进一步构建了Col1a1^BFP报告基因小鼠用于表征Col1a1⁺成骨细胞。通过示踪实验他们发现，稳态下成骨细胞来源于骨髓和骨外膜生发层的骨骼干细胞（CL-PC），而纤维层细胞保持静息不参与骨的生成。骨折修复过程中成骨细胞主要来源于纤维层细胞（FL-PC），纤维层细胞在骨折过程中生成了纤维软骨骨痂的主体部分和绝大部分的新生皮质骨。骨折完全愈合后成骨细胞来源于在修复过程中迁移到骨髓和骨外膜生发层处的纤维层细胞，这群细胞在骨髓和生长层处长期存在并持续成骨。这些结论打破了人们以往对骨外膜纤维层细胞不具有成骨能力的认知，并鉴定到了骨折损伤修复中真正的功能细胞。

此外他们对迁移到骨髓和骨外膜生发层处的纤维层细胞进行了研究。利用单细胞转录组测序结合体外分化和体内移植实验发现，这群纤维层来源的细胞成骨分化相关转录因子表达水平低且体内外成骨活性远低于原有的骨髓和生发层处的骨骼干细胞。这种成骨干细胞成骨活性的降低在宏观层面反应为愈合骨的骨质量下降。通过Micro-CT成像发现，骨折愈合处的皮质骨的多项骨参数显著地低于正常骨和相邻骨。这一发现告诉人们由于成骨细胞的干细胞来源的转变，即使外观上不明显骨头也会留下隐形的“疤”，解释了为什么人在之前发生过骨折的位置更容易发生二次骨折。研究提示如果能够阻碍纤维层细胞侵入骨髓和生发层，有望让愈合骨的骨质量显著性地提升。这也将是团队下一步的重点攻关方向。

分子细胞卓越中心博士生刘逸铭为该论文第一作者，博士生唐新宇和博士生舒慧是该论文的共同第一作者。周波和邹卫国研究员是该文的共同通讯作者。这项工作获得中国科技部、国家自然科学基金、上海市以及中国科学院的基金支持。分子细胞卓越中心SPF动物实验技术平台和细胞分析技术平台为本工作提供了大力支持。

文章链接：https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(24)00187-4

图1. SSC-Simultracer骨骼干细胞同步示踪系统示意图

图2. 骨折前后成骨细胞的干细胞来源的转变示意图