Nature Methods新研究提高了高通量测序中分子定量的准确性

　　

牛津大学纳菲尔德骨科、风湿病学和肌肉骨骼科学系(NDORMS)的一个研究小组开发了一种新方法，可以显著提高RNA测序的准确性。他们指出短读和长读RNA测序中不准确定量的主要来源，并引入了“多majority vote”纠错的概念，从而大大提高了RNA分子计数的准确性。

遗传物质的准确测序在现代生物学中是至关重要的，特别是对于理解和解决与遗传异常有关的疾病方面。然而，目前的方法遇到了很大的限制。

在一项具有里程碑意义的研究中，由牛津大学计算生物学副教授Adam Cribbs和博士后Jianfeng Sun领导的一个国际研究联盟开发了一种创新的方法，用于纠正高通量测序中广泛出现的PCR扩增错误。

这一研究发表在《自然方法》(Nature Methods)杂志上，研究指出PCR人工产物是定量不准确的主要原因，这解决长期以来在生成准确的RNA分子绝对计数方面所面临的挑战，这对基因组学研究的各种应用至关重要。

在这篇文章中，研究人员重点研究了特异性分子标记(Unique Molecular Identifiers, UMIs，生物通注)，这是一种随机的寡核苷酸序列，用于消除PCR扩增过程中引入的偏差。虽然UMIs已被广泛应用于测序方法，但该研究表明，PCR错误可能会破坏分子定量的准确性，特别是在不同的测序平台上。

Jianfeng解释说:“PCR扩增对于大多数RNA测序技术来说都是必不可少的，但它可能会引入误差，损害数据的完整性。我们通过使用同源三聚体核苷酸块合成UMI条形码来解决这个问题，增强了纠错能力，实现了近乎绝对的RNA分子定量，显著提高了分子计数的准确性。”

同源三聚体是由三个相同碱基组成的核苷酸序列，如AAA、CCC、GGG。通过评估同源三聚体核苷酸相似性，研究人员可以通过“majority vote”方法检测和纠正错误(图1)。

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图1:显示同源三聚体UMI多数投票错误纠正的示意图。我们用同源三聚体核苷酸块(由AAA、CCC、GGG、TTT组成的组合)构建了UMIs。通过评估三聚体核苷酸的相似性，通过“majority vote”系统识别和纠正删除、插入或替代的错误，选择最常见的核苷酸。

该研究表明，在分析差异表达基因和转录本(DEGs和DETs)时，同源三聚体UMIs在减少假阳性折叠富集方面明显优于传统单体UMIs。这种增强对于DEGs或DETs的准确识别和定量至关重要，特别是在批量测序方法中。此外，在单细胞测序中，通常需要广泛的PCR扩增，同源三聚体UMIs已被证明可以有效减轻PCR人工产物的影响，从而大大提高测序数据的可靠性。

“通过构建同源核苷块的UMIs，我们的目标是提高短读和长读测序的纠错能力，这是我们对提高测序技术应用的承诺，”Cribbs副教授说。

这项研究具有深远的意义。通过纠正UMIs中的PCR误差，极大地提高了各种测序应用中的分子定量准确性。它是大量RNA、单细胞RNA和DNA测序研究人员的重要工具，可以实现准确的基因表达和分子谱分析。增强的UMI纠错不仅减少了假阳性的发生率，而且还提供了多种诊断应用，特别是在需要对样本进行纵向分析的情况下。

原文标题：

Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules