如何使用NanoDrop OneC进行酶促动力学测定？

前言

大肠杆菌lacZ基因与β-半乳糖苷酶（β-Gal）遗传调控模型是研究较多的模型之一。β-Gal将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，同时产生能量。在β-半乳糖苷底物（例如乳糖）的存在下，乳糖的阻遏蛋白构象发生变化，合成β-Gal以分解底物。LacZ基因的产物β-Gal通过吸收光谱监测真核细胞的转染效率。为了监测β-Gal的活性，底物邻硝基苯基-β-D半乳吡喃糖苷（ONPG）经β-Gal水解生成黄色生色团邻硝基苯酚（ONP），并在420 nm处测定吸光度。

图1：邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)经β-GAL水解生成黄色生色团邻硝基苯酚(ONP)。

NanoDrop OneC分光光度计配置有比色皿模块，这一模块能够实时监测动力学反应。同时比色皿模块可以在37℃条件下孵育样品，并可以设置不同的搅拌速度混匀样品。ONPG的水解会在400nm处产生一个范围较宽的吸收峰，高pH抑制剂能够使β-Gal变性，此时的吸光度迅速增加，同时吸收峰移动到420nm处（图2）。在420nm处的吸光度可以用来计算β-Gal的比活力，这是衡量酶纯度的标准。在动力学实验的上游对蛋白质浓度进行量化，以此来计算酶的比活力。

图2：加入高pH值的抑制剂，吸光度增加，吸收峰从400nm移动至420nm。

实验程序

01 NanoDrop OneC中的软件设置

图3概述了NanoDrop OneC动力学方法在软件中的参数设置。实验设置了两个阶段：第一阶段不包括开始测量的延迟，吸光度以一分钟为间隔监测30次，总持续时间为30分钟。第二阶段包括30秒的测量延迟用于添加抑制剂，以30秒的间隔监测吸光度，共设置3个间隔，总持续时间为2分钟。温度设置为37℃，搅拌速度设置为9级，吸光度监测设置为420nm。

图3：NanoDrop OneC控制软件上设置的动力学参数。图中未显示监测420nm的波长，用户可以在方法设置中编辑延迟时间、间隔时间等，输入参数后软件会自动填充持续时间。

02 BCA蛋白测定法

Thermo Scientific Pierce™ BCA蛋白测定法用来定量细胞裂解物溶液中的蛋白质。将牛血清白蛋白（BSA）进行稀释，以浓度2.0mg/mL、1.5 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL建立标准曲线和归零校准。在单独的离心管中加入25µL标准溶液。配置5.0mL BSA工作液，在每个标准管和样品管中加入200µL。将混合物涡转混匀并在37℃下孵育30分钟，使用NanoDrop OneC上的微量底座测量每个标准品和样品在562nm处的吸光度，标准品测两次，样品测三次。

总结

01 BCA蛋白测定法

图4所示为BCA测定的吸光度结果。标准曲线表现出很强的线性，R²为0.9916。细胞裂解液中蛋白质平均浓度为1.65mg/mL，三次测量的平均值具有较高的重复性(SD=0.003)。

图4：BCA法在562 nm处测定吸光度。标准显示为深蓝色，β-Gal显示为橙色。标准1：归零校准。标准2：0.5mg/mL。标准3：1.0mg/mL。标准4：1.5mg/mL。标准5：2.0mg/mL。

02 NanoDrop OneC动力学数据

如图5所示，ONP在420nm处的吸光度与几种酶的稀释比例呈线性关系（R²=0.9968）。结果表明，测得的酶浓度在线性范围内，这也证实了酶的比活计算不受非线性酶浓度的影响。

图5：ONP在420nm处的吸光度与酶浓度关系图（R²=0.9968）

NanoDrop OneC可以集成到分光光度酶促动力学反应中。该方法中使用的BCA蛋白比色法是在动力学反应前测定细胞裂解物中蛋白质浓度的关键组成部分。由于细胞裂解液含有许多杂质，进行标准的A280测量会影响真实的蛋白质浓度。NanoDrop OneC仪器包括预编程的BCA分析应用程序，用比色皿进行定量使实验变得快速和简单。如果细胞裂解液的体积有限，NanoDrop OneC仪器也提供了更加节省样品体积的微量底座来完成BCA分析。

使用NanoDrop OneC分光光度计监测ONP的产生，同时测试和分析仪器的线性，以确保评估酶活性的准确性。获得的吸光度数据证明了NanoDrop OneC仪器作为监测酶活性的工具的可靠性，数据中的R²值同样证明了这一特点。

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