qPCR实验不用慌，NanoDrop帮你忙！

NanoDrop One/OneC

由于荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR/qPCR）实验操作简单，检测速度快，灵敏性高和特异性好等特点，qPCR已成为核酸定量实验的金标准。在进行qPCR实验时，核酸样本必须以特定的浓度加入，并且要求其中没有污染物质，然而传统的分光光度计不能识别在260 nm波长下与目标样品共吸收的污染物，如RNA样品中的DNA污染。这一缺点导致实验人员高估样本浓度，进而影响qPCR或RT-qPCR结果。

NanoDrop One/OneC超微量紫外分光光度计可以应用于qPCR/RT-qPCR的核酸质控中，其中的Acclaro™智能样本检测技术能够检测存在于DNA样本中的RNA污染或RNA样本中的DNA污染。

污染物鉴定界面

图1：Acclaro智能样本检测技术鉴定的DNA污染的RNA光谱，以及校正的RNA浓度和光谱（黄色）

图2所示为dsDNA和RNA应用Acclaro™智能样本检测技术可以识别的污染物。

图2：可以识别的dsDNA和RNA中的污染物

接下来我们一起看下它在qPCR实验前质控的实际表现吧!

提取人淋巴细胞的总RNA和基因组DNA，在100 ng/µL RNA样本中掺入25 ng/µL的gDNA。提取人肿瘤细胞基因组DNA，100 ng/µL gDNA样本中掺入50 ng/µL的RNA。

在NanoDrop One/OneC仪器上测量添加了污染物的RNA和gDNA样本，确定Acclaro™智能样本检测技术报告的校正浓度和原始浓度(图3)。随后将原始浓度和校正后的浓度稀释到25 ng/µL，然后加载到qPCR仪器上进行RT-qPCR和qPCR实验。

图3：在NanoDrop One/Onec上测量添加污染物的核酸样品的浓度以及校正后浓度

Part 01.

一、RT-qPCR实验

图4显示当RNA中掺入gDNA时对Cq值的影响。与对照组相比，不管模板使用校正浓度还是原始浓度构建的两组PCR体系，其Cq值均升高。使用校正浓度构建的PCR体系，其Cq值仍然高于对照组，因为样品中仍然存在gDNA污染。

Acclaro™智能样本检测技术可以鉴定RNA样本中DNA污染，但结果表明，必须在RT-qPCR之前对RNA进行纯化，以提高准确性和重复性。

图4：RNA中的DNA污染对Cq值的影响

Part 02.

二、qPCR实验

图5显示当DNA中掺入RNA时对Cq值的影响。与对照组相比，不管模板使用校正浓度还是原始浓度构建的两组PCR体系，其Cq值均有误差。使用校正浓度构建的PCR体系，其Cq值低于对照组，因为样品中仍然存在RNA污染。

Acclaro™智能样本检测技术可以鉴定DNA样本中RNA污染，但结果表明，必须在qPCR之前对DNA进行纯化，以提高实验的准确性和重复性。

图5：DNA中的RNA污染对Cq值的影响

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基因有限公司自2004年成为NanoDrop Technologies公司（2007年被Thermo Fisher Scientific公司并购）在中国区的合作伙伴，至今已有近20年的合作历史，负责NanoDrop全系列产品线的售前咨询、售后安装、应用培训和维修维护等服务。目前在中国有数万台装机，服务了几十万用户。