周斌研究员受邀发表谱系示踪新技术在心血管研究中应用的综述

　　

2月15日，国际学术期刊Circulation Research在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组与香港中文大学医学院Kathy O. Lui教授的合作综述文章“Application of New Lineage Tracing Techniques in Cardiovascular Development and Physiology”。该论文回顾了近些年来新的遗传谱系示踪技术在心脏发育与再生研究中的应用，详细介绍了双同源重组系统以及邻近细胞系统在心脏多种细胞类型研究中的发展与应用，主要围绕心肌细胞、冠状血管以及间充质细胞群展开介绍。

心脏是第一个发育并通过复杂的血管网络循环贯穿全身的器官，从而提供营养和激素，促进氧气和二氧化碳的交换，并在生物体的整个生命周期中维持免疫监视。不同类型的心血管细胞和谐地协调维持正常心脏功能的过程。多种细胞系在基因表达、细胞状态决定和细胞命运转换方面经历动态变化，以促进、适应甚至调节疾病进展过程中的病理生理过程。过去三十年间，心血管疾病一直是世界范围内死亡率和发病率的主要原因。因此，了解发育、衰老和疾病进展过程中的细胞异质性、起源和命运多样性，有助于开发新的心血管疾病治疗策略。迄今为止，基于单一位点特异性重组后的永久、不可逆和可遗传的细胞追踪方法已经丰富了人们对包括心脏在内的多器官系统中靶细胞发育轨迹的理解。其中最被大家广泛使用的则是Cre-loxp重组系统，除此之外还有一些与其正交的重组系统，包括Dre-rox，Flp-frt，Dre-rox，以及Nigri-nox。然而，许多由单基因启动子驱动的重组酶表现出特异性不足，并且一些基因的驱动是瞬时的，单重组系统很难做到完全捕捉。近年来，一系列创新性的谱系追踪技术已经出现，利用不同的正交重组酶的组合来揭示心脏发育、疾病、修复和再生过程中多细胞复杂性的更深刻和精确的见解。该论文通过使用这些前沿的方法来分析心脏的三种主要细胞类型:心肌细胞、内皮细胞和间充质细胞的功能起源，总结了这些新发现。该论文提供了基于正交重组酶的新的遗传谱系追踪工具如何绕过以前的技术限制并解决心血管领域的难题的详细示例。

在心脏的发育过程中，该论文举例总结了利用双重组酶系统揭示不同来源的心肌细胞在心脏中的定位以及揭示Isl1不仅仅代表第二心场祖细胞的研究，揭示了新的遗传谱系示踪技术在心脏发育领域内揭示新的发现以及完善先前研究结论的重要作用。除此之外，该论文还举例总结了心肌细胞的来源问题，利用双系统解决了成体心脏中c-kit⁺心肌干细胞是否存在的问题，由于c-kit也在一些心肌细胞中表达，利用开发的新双重组酶报告基因系统，研究者们特异性地排除所有c-kit⁺心肌细胞，标记所有的c-kit⁺非心肌细胞，揭示了成体干细胞中并没有c-kit⁺心肌干细胞的存在。另外有研究者利用开发的新的不依赖于特定的心肌干细胞标记物的双同源重组系统，揭示了在成体心脏中不会有任何心肌干细胞的存在，新的心肌细胞只会来源于原有的心肌细胞；同时利用新的系统揭示了只有在胚胎早期存在非心肌细胞向心肌细胞的转化，在胚胎期E11.5天之后几乎不再有非心肌细胞向心肌细胞的转化，表明新的遗传谱系示踪技术在解决有争议的科学问题中的重要作用。除了利用报告基因来构造双重组酶系统外，该论文还总结了近年来研究者们利用一种诱导型同源重组酶来释放另一种持续性重组酶的双重组策略，举例揭示了心肌细胞这种增殖极为缓慢的细胞的增殖规律，双重组酶介导的遗传示踪平台促进了心肌细胞增殖在特定窗口的连续记录，以高分辨率提供了有价值的增殖心肌细胞的时空信息。

在冠状血管系统中，该论文总结了近年来通过双重组酶系统特异性地对冠状血管以及淋巴管进行标记、示踪甚至调控基因的表达，在排除调控的基因对其它器官的血管以及心脏其它细胞类型的影响下，特异性地揭示特定基因对于冠状血管或者淋巴管的调控作用。另外，该论文还总结了实现高效示踪的同时实现基因调控的新遗传谱系示踪技术，总结了这些技术在揭示冠状动脉发育机制以及心内膜多能性机制上的重要作用。除此之外，该论文还总结了利用双同源重组酶结合动脉内皮细胞标志物驱动的报告基因系统，揭示成体心肌梗死后存在的毛细血管转变为冠状动脉的现象。另外，近年来有研究者开发了利用细胞-细胞接触示踪系统，以实现在体内生理条件下示踪与配体细胞接触过的配体细胞。该论文对此系统进行总结，并总结了该系统特异性标记心脏的内皮细胞，再次揭示心脏的内皮细胞可以贡献到肝脏血管内皮细胞的现象。在该论文中还提到在未来，将细胞间遗传示踪技术与正交重组酶介导的基因组编辑相结合，可能为了解心血管发育和发病过程中的细胞起源和命运可塑性提供新的机会。

该论文还总结了新的双重组酶系统在心脏间质细胞中的研究，总结了利用新的双重组酶技术揭示的内皮细胞在胚胎期发生内皮细胞向间质细胞转化（EndoMT），但在成体心脏中，即使是损伤后也不会发生EndoMT，成体心脏中新的成纤维细胞来源于已经存在的成纤维细胞。该论文还总结了不同发育来源的成纤维细胞在心脏中的不同定位以及对于损伤的不同响应，总结了心脏成纤维细胞的异质性与其细胞来源之间的关系。同时，由于间质细胞的异质性，该论文还总结了利用双重组酶系统揭示不同间质细胞亚群向脂肪细胞或者血管平滑肌细胞转化的异质性。该论文还总结了在损伤情况下，比如动脉粥样硬化中，利用相应新开发的双重组酶系统揭示了血管平滑肌细胞会经历不同的状态转变为不同的细胞类型，总结了新的遗传谱系示踪技术可以揭示动脉粥样硬化斑块中细胞的状态乃至命运的转化。该论文总结了以上研究可以为治疗心脏纤维化或者动脉粥样硬化等心脏疾病提供新的治疗靶点以及治疗手段。

总的来说，该论文总结了近些年在心脏研究中开发的新的遗传谱系示踪技术以及利用这些新的技术得到的新结论或者解决的领域内存在已久的争议，这些总结进一步加深人们对心血管疾病发生和发展过程中细胞命运维持和转化的分子机制的理解，为后续提出新的干预治疗靶点与方式提供了一些有利支持。该论文还对未来开发新的遗传谱系示踪技术以及与其他技术如单细胞测序技术，条形码示踪技术等的结合有着新的展望。

分子细胞卓越中心周斌研究组博士研究生张铭珺为该文的第一作者，周斌研究员与香港中文大学医学院的Kathy O. Lui教授为该文的共同通讯作者。该项工作得到了来自中国科学院、基金委、科技部、上海市科委、香港研究资助局以及新基石等项目的经费支持，以及分子细胞卓越中心动物实验和细胞分析技术平台的帮助与支持。

文章链接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.123.323179

双重组酶系统在心血管研究中的应用