上海交大宋萍课题组发文揭示核酸杂交热力学开发针对肿瘤组织热点突变的高通量检测新方法

　　

DNA突变是癌症诊断的重要生物标志物，在癌症的早期识别和转移监测中发挥着关键作用，尤其是低频突变。在FDA批准的突变检测试剂中，124种被指定用于组织活检，47种用于液体活检，组织样本仍然是检测DNA突变的主要依据。但由于肿瘤异质性高，对于低变异等位基因频率（VAF）的样品，需要检测灵敏度高的方法来避免假阴性结果。另一方面，人类基因组中存在3.1%的突变热点和0.2%的热点簇，如KRAS（外显子2~4）和TP53（外显子5~8）、EGFR和BRAF基因。这些热点和热点簇与癌症的发生、进展和患者生存有关。例如，BRAF基因突变热点簇的患者生存率较高，而TP53和EGFR基突变热点的患者生存率较差。因此，开发能够检测热点区域低频突变的方法至关重要。

为此，上海交通大学生物医学工程学院宋萍课题组开发了基于核酸杂交热力学能调控的Long Blocker Displacement Amplification技术发表在Angewandte Chemie International Edition（https://doi.org/10.1002/anie.202400551）

研究者构建了一种长抑制探针置换扩增技术（Long Blocker Displacement Amplification, LBDA）实现了针对组织样本中肿瘤热点突变的高灵敏、高通量检测。该技术基于核酸杂交热力学能的精准调控，利用正向引物和抑制探针之间的链置换反应，并探究了影响杂交热力学能的因素包括温度、盐浓度等，实现对突变位点放大检测区间较常规抑制探针扩增技术高2倍，从而获得了可以实现单重探针单管同时检测81个不同的核酸突变，检测限最低可以达到0.01%。

图1 LBDA的设计原理及常规方法对比

团队首先探索了针对特定核苷酸设计的单个Long Blocker的抑制能力及其对各种突变类型的富集能力。将rs10508599 (T)的合成DNA模板定义为野生型模板（WT），将三种类型的突变(G、C、A)定义为突变型模板（MT），并根据WT序列设计长阻断剂。

根据实验结果，LBDA可以在一次反应中检测到低至0.5%变异等位基因频率(VAF)的不同突变类型，与野生型相比，21个突变DNA模板的中位富集倍数为1000倍。LBDA能够在富集区富集所有与WT序列不同的变异。

图2 LBDA在不同突变中的验证

根据国际癌症研究机构(IRAC)的报告，结直肠癌是全球第三大流行癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。KRAS和NRAS突变在结直肠癌中很常见，经常发生在突变热点。

图3 LBDA在KRAS、NRAS的合成模板中测试结果

因此研究者利用LBDA-qPCR检测KRAS和NRAS突变热点，利用单条Long Blocker能够覆盖81个突变类型（数据参考COSMIC），在合成模板和结直肠癌组织样本中分别进行了测试。此外，通过Sanger测序验证突变类型，与下一代测序结果一致。

图4 LBDA在临床样本中测试结果

本研究中LBDA-qPCR方法是检测癌症中低频突变的一种有效而灵敏的工具，特别是可以富集突变热点簇的区域。实验中单个Long Blocker可以富集高达44 nt的各种突变类型，同时仅用20 ng DNA输入即可实现10,000倍的突变富集。研究者设计用于检测KRAS和NRAS突变的LBDA-qPCR。在临床样本中测试的结果揭示了结直肠癌组织中肿瘤的异质性，以及组织与血液样本之间的异质性。总之，LBDA-qPCR具有高通用性和高灵敏度，是一种全面、灵敏地检测癌症遗传变异的实用方法。

作者：

宋萍

供稿单位：

生物医学工程学院