人类GBP1防御复合体的细胞自主免疫感染的天然结构

【字体：大中小】 时间：2024年03月02日 来源：AAAS

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　　人体细胞有许多机制来检测和应对细菌和病毒的入侵。识别细菌细胞壁成分的蛋白质可以包裹在入侵细菌的表面，并作为信号蛋白和抗菌酶组装的支架。

编者总结

人体细胞有许多机制来检测和应对细菌和病毒的入侵。识别细菌细胞壁成分的蛋白质可以包裹在入侵细菌的表面，并作为信号蛋白和抗菌酶组装的支架。朱等．进行遗传、生化和结构实验，揭示这种大蛋白复合物是如何形成的，并了解它是如何保护细胞免受细胞内感染的。低温电子断层扫描显示，GBP1的单体和二聚体在细菌上形成均匀的涂层，中等分辨率的重建表明，扩展的构象允许蛋白质插入并破坏细菌的外膜。——迈克尔·a·芬克和斯特拉·m·赫特利

结构化的抽象

介绍

真核细胞的区隔景观为微生物病原体的隐藏和复制提供了各种各样的细胞内生态位。因此，真核生物进化出了室特异性免疫监视机制，提醒宿主注意感染，并招募抗菌蛋白，帮助控制微生物复制。许多这些宿主防御蛋白在遇到病原体或其产物时形成巨大的大分子复合物，以放大先天免疫信号，并在微生物识别位点的空间上定位蛋白质伴侣。在某些情况下，完整的信号级联直接建立在入侵病原体本身上，这是一种独特的情况，在这种情况下，一个巨大的外来物体充当了组装整个宿主防御机制的锚定平台。这些巨大的宿主-病原体平台是如何在分子水平上启动和结构组织的仍然未知。

基本原理

自从十多年前在抗菌素和先天免疫信号复合物的物理组装中被发现以来，鸟苷酸结合蛋白(gbp)已成为动物和植物中广泛的细菌、病毒或寄生虫的细胞内宿主防御的主要组织者。在哺乳动物中，这些大型动力蛋白样鸟苷三磷酸酶(gtpase)迁移到细胞内病原体，在那里它们可以在微生物外膜(OM)上建立大分子组装，作为炎症蛋白或杀菌效应物的相互作用中心，作为细胞自主先天免疫反应的一部分。为了更好地了解这些不同杂交结构背后的机制细节，我们利用宿主和细菌遗传学以及单粒子纳米显微镜和低温电子断层扫描(cro - et)来观察革兰氏阴性细菌病原体表面的GBP防御复合物。 沙门氏菌血清血清型鼠伤寒( 扫描隧道显微镜)，在人类细胞的细胞质中。

结果

我们发现了一个多蛋白防御复合体直接组装在 扫描隧道显微镜在人体细胞内。这种防御复合体包括人类GBP家族的四个成员(GBP1、GBP2、GBP3和GBP4)、人类caspase-4及其天然底物之一全长Gasdermin D (GSDMD)。它通过caspase-4将GSDMD切割成其形成孔的亚基，从而触发先天免疫信号，导致免疫细胞因子白介素-18 (IL-18)的细胞外释放，并导致热亡细胞死亡，这是抵抗这种细菌病原体所必需的。值得注意的是，人类GBP1是启动整个信号级联的专性;它的基因去除阻止了剩余的免疫蛋白被招募到革兰氏阴性细菌表面。c端锚定和gtpase驱动的自组装使GBP1能够结合并在细胞质表面聚合 扫描隧道显微镜建立招聘平台。在短短几分钟内，近30,000个GBP1分子被组装起来。用细菌微型细胞系统重建这个巨大的GBP1防御复合体，可以在其天然状态下对整个外壳结构进行低温电镜观察。在这个天然平台中，单个GBP1二聚体被发现采用开放的构象，通过其延长的c端脂化尾部垂直插入细菌OM。直立的GBP1构象锚定导致OM破坏，释放革兰氏阴性细胞壁成分脂多糖(LPS)，激活共组装的caspase-4。

结论

先天免疫信号级联的一个新兴范例是重复蛋白质单位的高阶组装，产生能够放大信号转导的大聚合物。我们的研究结果确定人类GBP1是主要的重复单元，每个芽孢杆菌有数千个蛋白质，它经历了戏剧性的构象开放，直接在革兰氏阴性菌表面建立宿主防御平台。该平台能够招募其他免疫伙伴，包括GBP家族成员和炎性体途径的组成部分，它们在激活细胞因子(如干扰素-γ)的下游启动保护性反应。阐明这种巨大的分子结构不仅扩大了我们对人类细胞如何识别和对抗感染的理解，而且可能对人类群体中的抗菌方法也有影响。

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摘要。

所有生物体都部署细胞自主防御来对抗感染。在植物和动物中，大的超分子复合物通常会激活免疫蛋白以提供保护。在这项工作中，我们解决了大量宿主防御复合物的天然结构，该复合物在人类细胞内的革兰氏阴性细菌表面聚合30,000鸟苷酸结合蛋白(GBPs)。这个巨大的纳米机器的构建需要几分钟，并保持稳定数小时，需要鸟苷三磷酸水解，并招募了四个GBPs加上caspase-4和Gasdermin D作为细胞因子和细胞死亡免疫信号传导平台。低温电子断层扫描表明，GBP1可以采用细菌插入膜的延伸构象来建立这个平台，触发脂多糖释放，激活共组装caspase-4。我们的“开放一致性”模型为人类GBP1防御复合体如何动员先天免疫感染提供了一个动态的视角。

在生物系统中，环境信号通常通过配体诱导的细胞表面受体的变构变化来感知，这种变化迅速将信号传递到内部，以调动所需的生理反应。在植物和动物的细胞自主防御系统中(1,2)，额外的模式被用于解码外部世界，包括通过螺旋对称形成的细胞内蛋白质组装(3,4)。这些高阶组装通过蛋白质聚合或“朊化”事件放大先天免疫信号，以促进潜在酶原、半胱天冬酶和激酶的邻近诱导自激活。这种重复设计的好处是多方面的:降低信号阈值，全有或全无的响应性，以及稳定的信号体平台，可以招募和容纳大量的蛋白质伴侣(3)。

这种产生延伸的丝状信号平台的能力部分源于所涉及的蛋白质的模块化。信号小体蛋白通常含有富含亮氨酸的重复结构域、半胱天冬酶激活和募集结构域(CARDs)，或通过协同作用将受体、适配器和效应器集中在一起的死亡效应结构域(3)。因此，它们在免疫激活细胞内产生一些最具标志性和可见的结构。这些包括视黄酸诱导基因I丝和线粒体抗病毒信号蛋白朊病毒样结构，控制RNA传感;CARD和核苷酸结合域，富含亮氨酸(NLR)的蛋白丝作为炎性小体机制的一部分;核因子κB和干扰素(IFN)调控因子信号传导的核小体;和NLR hopz激活的抗性1五聚体，它们是植物抗性体的基础(3-6)。总的来说，这些大型聚合物结构代表了在后生动物进化过程中细胞自主先天免疫的日益普遍的范式。它们的组装方式不同于经典的抗原或免疫球蛋白在质膜上的信号传导，后者通常通过聚集的突触传递(3)。

在这一列表中，现在可以添加被称为鸟苷结合蛋白(GBPs)的动力蛋白样鸟苷三磷酸酶(GTPase)家族成员，这些成员通过聚合产生先天免疫信号平台和协调局部抗菌活性。GBPs在内部组装成大型多聚体结构 拟南芥，斑马鱼，老鼠和人类细胞，在某些情况下使用相分离来进一步浓缩同型复合物( 7- - - - - - 12)。在植物中，69- 122kda的gbp样蛋白(GBPLs)响应可诱导的免疫信号，包括水杨酸和细果酸，在感染期间组装大的核RNA聚合酶II枢纽转录宿主防御基因( 7， 8)。在动物中，免疫细胞因子如ifn诱导65- 73 kda GBP表达，以控制免疫和非免疫细胞胞浆内的杀微生物或炎性体反应( 9- - - - - - 13)。这些活动通常与GBPs迁移到微生物复制位点相一致，在那里它们完全“包裹”目标病原体，以建立中尺度信号传导或杀伤平台( 9， 12- - - - - - 16)。gbp包被病原体的大小范围从直径约750纳米到 沙门氏菌血清血清型鼠伤寒( 扫描隧道显微镜)至>5 μm 刚地弓形虫个( 17）.

组装如此大的外壳复合体必须获得与动力蛋白(dynamic -like proteins, dlp)相同的生化特性。dlp通常表现出强劲的GTPase活性( k _猫， ~2 ~ 100分钟 ^?1)，低微摩尔底物亲和力和核苷酸依赖的自组装，在细胞内产生>0.5- 1-MDa复合物( 18， 19)。因此，它们是“大型”gtp酶，通常在囊泡运输、细胞器分裂或细胞质分裂过程中起机械酶的作用，使膜变形或管化( 18， 19)。人类GBPs也表现出很高的内在催化活性( k _猫， ~80分钟 ^?1)以三磷酸鸟苷(GTP)为原料，经两步水解反应( 20， 21)。GTP水解可能引发构象变化，导致GBP二聚体的协同自组装。在结构上，所有人类GBPs都具有一个大的球状(LG) n端催化结构域和延伸的α-螺旋c端尾部( 19);后者跨越了包含α7 - α11螺旋的中间结构域(MD)和包含α12和α13螺旋的GTPase效应结构域(GED) ( 20， 22， 23)。在人类GBP1和GBP5晶体结构中，GED紧密地折叠回LG和MD区域( 20， 22， 23)。这可能是一种封闭的自抑制状态，因为在常规电子显微镜下，分离的GBP1的底物结合导致不同的几何形状( 24)。事实上，从理论上讲，底物催化可以释放GED，产生一个开放的、活性的二聚体，并进行进一步的多聚，尽管在GTP水解后直接在病原体表面捕获的高分辨率GBP结构尚未报道。此外，GBP1、GBP2和GBP5均具有c端CaaX基序，用于异戊二烯基修饰以促进膜结合( 19， 24)。异戊二烯化不仅可以提供锚定，还可以作为成核模板，使更多的GBPs沉积在微生物表面，从而在先天免疫过程中建立信号平台( 12- - - - - - 16）.

在这项研究中，我们利用冷冻电子断层扫描(cryo-ET)表征了一个由近30,000个GBP1分子组装在细菌表面的大规模免疫防御复合物。值得注意的是，尽管它们在植物和动物王国的宿主防御中起着核心作用(25-27)，但这些中尺度GBP外壳复合物在完整病原体膜上的超微结构组织目前尚不清楚。在光衍射极限下可视化这些结构将增强我们对真核细胞如何识别和对抗感染的理解。它还将提供在自然条件下触发先天免疫信号的GBP1外壳组装的信息。每一个都对抗感染治疗以及人类免疫识别和宿主防御的基本生物学具有重要意义。

人GBP1被毛大小、动力学和在纤维素中的稳定性

我们首先使用4Pi单分子开关(4Pi- sms)纳米显微镜和快速实时三维结构照明显微镜(3D-SIM)，利用配备高速振镜的OMX-SR Blaze成像仪器，检测了细胞质细菌周围的人类GBP1外壳复合物。4Pi-SMS是一种双物镜、单分子定位、超分辨率显微镜，可在整个哺乳动物细胞中以各向同性分辨率分辨~20 nm (200 ?)的3D结构( 28， 29);它使我们能够检测到毒株表面的单个GBP分子 扫描隧道显微镜在人体细胞内。使用OMX-SR仪器进行3D-SIM成像的速度可达每秒180帧，确保在整个细菌封装过程中都能跟踪涂层复合物的组装。

我们将GBP1作为人类DLP家族的前身。最近的研究发现，人类GBP1募集到细胞质侵袭性病原体的外膜上，包括 扫描隧道显微镜和 弗氏志贺菌在IFN-γ激活的原代人肠上皮、肌成纤维细胞和内皮细胞以及HeLa CCL2细胞中，载脂蛋白L3 (APOL3)具有杀菌活性( 13)。我们和其他人也报道了GBP1招募额外的GBP家族成员和内源性人caspase-4来刺激细胞因子释放[白细胞介素-18 (IL-18)]和原代肠道人类器官、人巨噬细胞和人上皮细胞系的焦亡( 12， 14- - - - - - 16)。因此，GBP外壳复合物已成为人类细胞内宿主防御和先天免疫信号传导的中心枢纽。

为了通过实时3D-SIM成像实时观察GBP1外壳复合物的形成，我们使用CRISPR-Cas9删除了人HeLa CCL2细胞中的内源性GBP1，并用功能性单体红色荧光蛋白(mRFP) -GBP1报告基因(GBP1)取而代之 ^{——/ -mRFP-GBP1})在生理水平检测，以避免过表达伪影(图S1A)。当被感染 扫描隧道显微镜表达增强绿色荧光蛋白( 扫描隧道显微镜^EGFP)， mRFP-GBP1在1 ~ 6分钟的时间内完全包裹了单个杆菌( 图1一个电影S1和S2)。在IFN-γ活化的GBP1中，内源性GBP1和GBP2在细菌表面的单分子4Pi-SMS成像也观察到全面涂层 ^+/+细胞，在某些情况下描述了共定位( 图1 b和电影。GBP1的体积和动力学测量结果显示，每个细菌以每秒103±11.6个分子的速度组装29,542±5156个分子(图S1, B和C)。

这种快速的动力学需要大量的GBP1协同作用，包括GTP和GDP的顺序水解，以实现GBP1二聚体在细菌表面核苷酸依赖的自组装，正如功能丧失突变体所揭示的那样。GTPase(1英镑 ^S52N)， GDPase (GBP1) ^DD103,108NN)，或二聚化(GBP1) ^D184N)突变体在稳定重组的GBP1中阻断了外壳的形成和下游IL-18的释放以及焦亡细胞的死亡(如LDH的释放) ^{- / -}细胞( 10） ( 图1,C到H)。值得注意的是，这些n端突变体仍然在c端CaaX基序的翻译后戊基化( 图1 f(见图S2, A和B)，这可能有助于将GBP1固定在细菌外膜(OM)上。事实上，突变CaaX盒子(GBP1) ^C589S阻止C15法尼化和人细胞内的外壳附着( 图1,F到H)。然而，通过使用过渡态类似物GDP加氟化铝(AIF)的尺寸排除色谱显示，它不会干扰核苷酸依赖性二聚体的自组装 ₃ ^{- - - - - -})，重组蛋白分析( 图1 e)。因此，GBP1突变体从随后的聚合中解耦OM附着，揭示了革兰氏阴性感染免疫过程中衣壳复合物形成的不同步骤。

OM锚定也需要一个多碱基贴片(氨基酸584至586)，类似于小H-Ras gtpase中的脂质结合基序( 30)在GBP1 c端α-13螺旋内( 20)(图S2, A和B)。所有三种精氨酸的丙氨酸扫描诱变(GBP1 ^{r584 - 586 a}(31)被皮形成消融，下游细胞因子和细胞死亡信号通路受损( 图1 h和图S2, C和D) ^{r584 - 586 a}在人类细胞内，被膜复合物组装的丢失并不是因为r584 - 586a取代干扰了附近CaaX基序的脂化( 图1 f)。相反，GBP1法尼化似乎是必需的，但对于OM的固定来说是不够的，需要第二个位点稳定地结合OM并帮助将其保留在细菌表面。

这种c端锚的二价性质在GBP1的脂多糖(LPS)结合谱中得到了加强 ^{r584 - 586 a}和1英镑 ^C589S从人胚胎肾(HEK)细胞中纯化的缺乏内源性GBP表达的突变体，以确保正确的法尼基连锁和后戊烯基加工( 32)(图S3、A和B)。脂多糖是革兰氏阴性OMs的主要成分(约75%) 扫描隧道显微镜） ( 33)，最近有报道说，它能结合人类GBP1 ( 15， 16)。我们发现 扫描隧道显微镜在荧光各向异性实验中，LPS在生理pH和温度下捕获法酰化的flag标记的GBP1[解离常数( K _d)， ~3.971 μM]，而未能捕获非法酰化的FLAG-GBP1 ^C589S非二聚体或催化突变体，或法酰化的FLAG-GBP1 ^{r584 - 586 a}(图S3B)。因此，GBP1与法尼基片段的组装对于 扫描隧道显微镜脂多糖与精氨酸贴片的结合在静电上加强了这些相互作用，以保持涂层的稳定( 15， 16)。在某些情况下，这种稳定性非常持久:实时成像显示，单个GBP1外壳可以在人细胞质中持续长达2至3小时(图S3C)。因此，成千上万的GBP1分子一旦通过最初的法尼基和多基接触锚定到细菌OM，就会产生一个高度持久的信号平台。

宿主和细菌决定因子GBP1包裹复合物组装

涂层的构建需要GBP1的c端附着和n端催化活性才能在整个上聚合 沙门氏菌表面。是否微生物的活动或细菌的物理特性也影响这一过程被工程学研究13 扫描隧道显微镜在大小、形状、运动性和OM成分上不同的菌株。 扫描隧道显微镜较长的分离株( 扫描隧道显微镜^pBAD-ftsZ，最大可达20 μm)，更宽( 扫描隧道显微镜^{MreB K27E}突变体，直径约2 μm)，或更小( 扫描隧道显微镜 ^Δ ^心在IFN-γ -引物细胞中，直径为250 - 300 nm的小细胞仍然募集内源性GBP1，以激活IL-18的释放和热噬细胞死亡( 图1,G和H)。弯曲 扫描隧道显微镜^{MreB D78V}突变体同样调动了这一途径( 34， 35） ( 图1,G和H)。因此，微生物细胞的大小、分裂或曲率似乎不影响GBP1外壳形成以产生先天免疫信号平台。Flagellin-expressing ( 36)和鞭毛蛋白缺乏 扫描隧道显微镜 ( 扫描隧道显微镜 ^Δ ^flhD)都被GBP1靶向，排除了运动性或细菌固定化作为开始外壳复合物组装的线索。

因此，我们转向OM本身。革兰氏阴性菌含有长多糖脂多糖链，形成二价阳离子交联屏障，疏水溶质( 37)。LPS部分由o-抗原多糖、外核半乳糖、内核庚糖和3-脱氧- d -甘露-辛糖酸(KDO)富集的糖类以及通过静电和疏水相互作用嵌入在碱基上的多个酰基链的脂质a模块( 图1克)。同基因的 扫描隧道显微镜具有逐渐变短的LPS链的突变体[通过在LPS生物合成途径的连续步骤中使酶失活而产生] ，38)]揭示了 扫描隧道显微镜 ^Δ ^wzy， 扫描隧道显微镜 ^Δ ^瓦尔， 扫描隧道显微镜 ^Δ ^waaJ， 扫描隧道显微镜 ^Δ ^waaI,或 扫描隧道显微镜 ^Δ ^waaG不阻断GBP1外壳形成和下游先天免疫信号传导( 图1,G和H）.

在这些截断的下面，我们修改了位于OM底部的脂质A模块，在那里它与磷脂内小叶相互作用;脂质A被caspase-4识别并直接结合( 39)。突变 扫描隧道显微镜蛋白LpxR, PagL，或PagP(去除一个3 ' -乙酰氧基片段)，去除一个单 R-3-羟基肉豆蔻酸链，或棕榈酰酸羟基肉豆蔻酸链)(40)未能阻止GBP1包被和caspase-4活化( 图1,G和H)。人乙酰氧基水解酶(AOAH)的CRISPR-Cas9缺失 ^{- / -})，它在HeLa CCL2细胞中低水平表达，并作为失活机制从脂质A中去除二级酰基链( 41)，或人E3泛素连接酶无名指蛋白213 (RNF213) ^{- / -})，通过泛素化修饰脂质A ( 42)，对依赖于涂层的信号传导也没有影响( 图1,G和H)。这样，功能性被毛就形成了 沙门氏菌主要受宿主GBP1活性控制，而不是脂质A修饰或细胞内(即活细胞内)的其他微生物决定因素。人类GBP1仍然靶向细胞质 扫描隧道显微镜无论细菌大小、形状、活力或OM组成如何;后者跨越了不同长度、电荷和化学结构的LPS链。这种广泛的配体混杂可能有助于GBP1对抗革兰氏阴性病原体，这些病原体修改其LPS片段，试图逃避先天免疫识别和抗菌杀伤。

人类GBP1外壳启动了细菌识别的多蛋白平台

GBP1与细菌表面广泛的多价相互作用为募集下游蛋白伙伴参与先天免疫信号传递提供了稳定的平台( 12， 13， 16)。我们和其他研究小组先前的工作发现，GBP2到GBP4和caspase-4在原代人肠道类器官和宫颈上皮细胞系中构成了GBP1信号传导平台的一部分( 12， 16)。在本研究中，稳定的CRISPR-Cas9缺失证实了它们的重要性，内源性caspase-4自身蛋白水解(以活性p30亚基表示)、IL-18释放和IFN-γ激活的GBP1的焦亡细胞死亡(作为LDH释放)显著减少 ^{- / -}和2英镑 ^{- / -}单敲除和GBP1 ^{- / -}2 ^{- / -}双敲除细胞(图S4, A至C) ^{- / -}和4英镑 ^{- / -}然而，整体移除整个335-kb人类的效果较小吗 1英镑来 7英镑通过基因组工程对染色体1q22.2 (GBP)进行聚类 ^{Δ1 q22.2})产生了几乎完全丢失的下游信号，强调了协同GBP作用和表型复制CASP4 ^{- / -}和GSDMD ^{- / -}(气胚乳蛋白D)细胞(图S4, A至C)。

完整的英镑基因簇缺失在七倍GBP ^{Δ1 q22.2}突变体提供了一个理想的工具，可以在空白背景下重建整个外壳复合体，并测试GBP1是否是同一杆菌上该分层复合体的关键组织者(图S4D)。我们纳入了全长GSDMD作为具有潜在杀菌活性的天然caspase-4底物( 43)，看看它是否也会被带到这个新的超分子平台上。每个涂层成分融合到七种荧光蛋白中的一种[mAzurite, msapire, pmTurqouise2, pmEmerald, pmVenus, pmOrange, pmCardinal，或pmIFP24;荧光激发和发射(E _x/ E _米)范围(384/450至684/708 nm)，以确定重组GBP的兼容组合 ^{Δ1 q22.2}作为exchange-PAINT的细胞缺乏合适的抗体来检测内源性蛋白(图S4, D和E) _{450 - 708})在感染90 ~ 120min后，成功地分离了五色物体，得到了一个完整的信号平台，GBP1到GBP4加上caspase-4或GSDMD都覆盖在同一杆菌上( 图2,A至C，图S4、F、G)。

值得注意的是，当GBP1被忽略时，这种多色外壳完全消失了，这表明GBP1从一开始就建立了整个信号级联( 12， 14） ( 图2、A、D)。的确是英镑大衣 _{450 - 708}实验发现，人GBP1对同时共享同一细菌表面的GBP2、GBP3、GBP4和caspase-4或GSDMD具有专性( 图2 d)。排除caspase-4对GBP1和GBP4没有影响，将它们置于上游，但它在很大程度上阻断了全长GSDMD的靶向，将其定位在这个六成员信号级联的下游，作为两步分层模型的一部分( 图2,C至F)。值得注意的是，模拟加工底物的N端或c端GSDMD片段未能被招募( 图2 e)。因此，一旦蛋白酶在被GBP1募集后被脂质A激活，caspase-4似乎只将其全长GSDMD底物带到该位置进行切割;这在单独删除的CASP4中也得到了证实 ^{- / -}或1英镑 ^{- / -}细胞( 图2 f)。通过跟踪该途径中另一个主要的caspase-4底物pro-IL-18，我们发现它在很大程度上未能被招募到外壳上。因此，GSDMD是GBP-CASP4信号复合物的新组成部分，是两步分层模型的一部分( 图2 f)。它与caspase-4的相互作用可能发生在到达GBP平台之前，正如GBP的共免疫沉淀试验所显示的那样 ^{Δ1 q22.2}细胞( 图2 g）.

LPS结合谱进一步支持了该分层模型( 图2 h)。FLAG-GBP1， -GBP2， -GBP3， -GBP4或-caspase-4 ^C258A(防止自身蛋白水解)( 39)从人HEK细胞中纯化，以避免细菌污染，并确保蛋白质经过翻译后修饰;1英镑( K _d， ~3.776 μM)和caspase-4 ^C258A ( K _d， ~313 nM)与 扫描隧道显微镜脂多糖是主要的OM结合蛋白( 13， 14， 39） ( 图2 h)。因此，GBP1是这种多蛋白复合物的主要组织者，位于被包裹的细菌的顶部( 12， 16)。它的组装促进了细菌通过caspase-4识别LPS脂质A片段，这可以招募GSDMD作为激活细胞死亡和下游细胞因子释放的后续步骤。

GBP1防御复合体在纤维素和重组系统中触发细菌LPS释放

GBP1外壳复合物如何促进caspase-4对LPS的识别，特别是考虑到脂质A埋在OM的底部，仍然是一个问题。我们首先探测了活菌在纤维素( 图3、A、B)。首先是铜(Cu ^{2 +}) free CLICK化学试剂用于标记 扫描隧道显微镜含有Alexa Fluor的LPS通过kdo叠氮化物衍生物在内核内与脂质A相邻( 图3)。反 沙门氏菌o抗原抗体用于验证KDO-Alexa荧光信号，该信号在传递到细胞质溶胶过程中减少。我们同样将荧光d -丙氨酸加入到L-Ala-D-中 内消旋-diaminopimelate-D-Ala - O-Ala五肽通过代谢标记活性细菌中潜在的肽聚糖(PG)支架( 44） ( 图3)。3D-SIM发现，完整的GBP1涂层触发了LPS的释放，但似乎并没有干扰LPS的释放 扫描隧道显微镜IFN-γ活化HeLa细胞胞浆内PG层( 图3 b)，证实了GBP1可以促进细胞中caspase-4配体的可用性。其他外显结构，如鞭毛，在gbp1包被的细菌( 图3 c);因此，GBP1主要影响OM的破坏，使PG支架和鞭毛器官保持完整。

接下来，我们直接检测脂质A的释放，以测试GBP1是否确实足以释放LPS。我们使用无细胞重构系统来测量可溶性脂质a，由于宿主细胞质被整个细菌污染，因此不能在原位进行。法尼化重组RFP (rRFP) -GBP1的无菌孵育 扫描隧道显微镜发现在添加GTP底物后60 min内，>95%的细菌被完全包被( 图3 d)。细菌被rRFP-GBP1包封遵循一个高度加速的s型曲线，产生最大值的一半(“外套”) K _米)，坡度为5.122 ( 图3 e)。值得注意的是，这种全有或全无的行为不是由跨越相变边界引起的，因为rRFP-GBP1不相分离，不像植物gbpl，在感染期间具有c端固有紊乱区域产生生物分子凝聚物( 6， 7)(图5a)。明显的涂层，不管 扫描隧道显微镜大小或LPS状态;与革兰氏阴性比较 Pseuodomonas绿脓杆菌和革兰氏阳性 单核细胞增多性李斯特氏菌结果表明，后两种细菌的rRFP-GBP1包封水平较低(图S5、B和C)。

值得注意的是，GBP1涂层复合体的重构引发了 扫描隧道显微镜脂多糖释放，通过鲎试剂(LAL)测定，检测可溶性脂质A片段。Unfarnesylated rRFP-GBP1 ^C589S法酰化的催化或组装突变体不能被包裹 扫描隧道显微镜即使在加入GTP后也不能释放LPS，模拟了在人细胞内观察到的结果( 图3 f)。遗漏GTP或用不可水解的GTP类似物(GTP-γ-S或GMPPNP)或过渡态模拟物(GDP)取代GTP。如果 ₃ ^{- - - - - -}或GMP。如果 ₄ ^{- - - - - -})也未能触发rgbp1依赖性LPS释放，因为这些类似物不能支持水解驱动的GBP1在细菌上的包被( 图3 f)。gtp依赖性rGBP1组装释放的脂质A量 扫描隧道显微镜大大超过了 K _dcaspase-4 ( 39)，但占总LPS的比例<1%[基于2 × 10] ⁶每个LPS分子数 扫描隧道显微镜 ( 31)]。因此，GBP1外壳复合体破坏LPS外叶;根据这种破坏的程度，它可能与炎性体激活甚至细菌杀死同时发生( 13， 15)。事实上，rGBP1与人rAPOL3共孵育会导致细菌活力的丧失( 图3 g)，因为GBP1的OM中断允许APOL3访问 扫描隧道显微镜下面的内膜( 13)。用不可水解的GTP-γ-S或GDP证实了这种依赖性。如果 ₃ ^{- - - - - -}不仅阻止了rGBP1外壳的形成和LPS的释放( 图3 f)以及随后的rapol3介导的杀伤( 图3 g)。因此，人类GBP1的插入似乎破坏了LPS-LPS的横向相互作用，从而损害了OM的完整性。这不仅激活了caspase-4炎性体通路，而且允许小的抗菌蛋白如APOL3通过，直接杀死致病菌( 13）.

细菌微型细胞系统使低温电镜和低温et的天然GBP1外壳

我们重组的外壳复合体为我们提供了观察GBP1组装和插入细菌外小叶以触发LPS破坏的机会。使用强大的成像工具，如冷冻电子显微镜(cryo-EM)和冷冻电子显微镜(cryo-ET)，可以描绘出GBP1的构象。我们设计了细菌微细胞和外膜囊泡(OMVs)，因为它们比等基因杆状杆菌小得多，但与人工脂质体或可溶性LPS不同，它们保留了病原体OM的完整特征( 图4)。更值得注意的是，微孔厚度的减小提高了低温et样品的分辨率( 34)，阴性染色电镜初步证实了这一点 扫描隧道显微镜迷你细胞和omv像亲本细胞一样被rRFP-GBP1包裹 扫描隧道显微镜1344菌株(图S6, A和B)。

小细胞是由不对称的细胞分裂( 图4);我们发现一个分离基因的过度表达， ftsZ，产出最小 扫描隧道显微镜微细胞(~150-300 nm)，与omv一起差速离心仍然可以分离完整(图S6C)。我们特意介绍 ftsZ过度表达 waaG缺乏LPS o抗原和外核段( 扫描隧道显微镜 ^Δ ^{waaG::pBAD-ftsZ})，因为这些片段具有非结构化密度，会干扰亚层析成像平均( 45)，移除它可以让我们在OM插入点附近看到更多的原生GBP1二聚体。由于脂质A区仍然完整，o抗原和外核片段对于GBP1外壳附着和人类细胞内的下游信号传导也是必不可少的( 图1,G和H)。因此，我们设计了双重遗传策略，以限制在冷冻et收集倾斜图像时的非特异性样本噪声。

Cryo-EM在200 kV下成功地重建了GBP1包被复合物 扫描隧道显微镜 ^Δ ^{waaG::pBAD-ftsZ}rfp - gbp1±GTP ( 图4 b初步的电磁测量发现，GBP1的范围约为25至27 nm，紧密地并置于整个细菌表面(图S6E)。在最近的一项研究中，法酰化的人类GBP1与不可水解的GTP类似物GMPPNP (PDB ID 6K1Z)结合的晶体结构中，该蛋白的长度是这个长度的一半(12.89 nm) ( 22)，最后的α13螺旋折叠回到α12 c末端，形成一个“封闭”的构象(图S6, E和F)。用低温电镜测量，要跨越~25到27 nm，至少需要两个垂直放置在彼此顶部的“封闭”GBP1分子，或4到6个水平排列并垂直于外层小叶的分子( 46)。另外，AlphaFold2建模( 47)发现GBP1可能经历其GED的动态c端延伸，从而将完全脱链的C15法尼基呈现给OM(图S6F)。这个“开放”扩展的共形体的预测长度为278 ?，这也符合EM测量结果。每个潜在的构型都通过冷冻- et和生化证据进行探测，以确定在天然条件下，当真正的底物GTP存在时，GBP1是如何直接作用于细菌表面的。

Cryo-ET揭示了数千个开放的GBP1构象插入到细菌OM中

接下来，我们使用300千伏冷冻- et在剂量分级模式下获得完全组装在细菌表面的人类GBP1外壳复合物的高对比度3D图像( 图4,C到H(图S7, A至L)。rRFP-GBP1荧光最初帮助我们定位了玻璃化样品中的包被杆菌，RFP的连锁并没有改变GBP1的总长度(图S6F)。在30,483次测量中发现了~280 ?的平均构象长度 扫描隧道显微镜 ^Δ ^{waaG::pBAD-ftsZ}和 扫描隧道显微镜 ^Δ ^心微型电池加上omv ( 图4、C、D，电影S4和S5)。从细菌表面放射出的细长的GBP1构象在多次断层扫描中可见( 图4,E到H，图S7G)。在粗分类过程中收集的44,891个颗粒中，有15,683个颗粒用于该天然宿主防御复合物的三维分割( 图4、G、H)。它分解了一层巨大的外套 扫描隧道显微镜 ^Δ ^{waaG::pBAD-ftsZ}直径达384纳米的微型电池(电影S6)。放大后的视图显示，当连接到OM时，似乎垂直直立的GBP1构象通常在寄存器中对齐( 图5）.

为了验证这种天然包被中的单个蛋白质结构，我们接下来使用无标签的rGBP1来确保RFP不会干扰横向包装，并在12858个颗粒上应用更紧密的最终掩膜进行亚断层图平均(STA)(图5B和图S8, A至C)。这种改进需要用户端脚本来适应未标记的GBP1的小尺寸(68 kda)，其灵活性和细菌OM上的密集阵列。使用这种策略,我们可以解决更大的1英镑二聚体及其较小的单体的亚基~ 9到17直接在细菌表面(图5,C和D,和无花果。S9, A到D)。在这些决议,LG,医学博士,期间可以划定区域(图5 D和无花果。S9, A到C)。本地1英镑采用非对称二聚体LGs扭曲和相对倾斜时附着在细菌OM(图5 D)。这可能类似于在人类GBP1结晶二聚体(PDB ID 7E5A)中发现的倾斜LGs(23)，尽管α12和α13 GED螺旋延伸到天然GBP1的LPS内核和脂质A区，产生最小长度为22.4 nm(图5,D和E)。因此，我们的冷冻et分析产生的一种可能性是人类GBP1在其功能状态下作为“开放”的构象(图5E);这与迄今为止报道的所有单体或二聚体GBP晶体结构形成对比，后者将GED置于“封闭”构象中(图5E)。

列举这些天然构象和细菌表面积存在于每个亚层析图段，以及总体尺寸测量 扫描隧道显微镜 ^Δ ^{waaG::pBAD-ftsZ}在小细胞中，我们发现有11,760±735个GBP1蛋白聚集在OM上，产生>1-GDa的结构。为成熟的棒状 扫描隧道显微镜，这推断出每个细菌约有22,000至32,000个GBP1分子，这与早期的原位光学显微镜估计一致。因此，Cryo-ET为这种巨大的免疫复合物提供了一个新的结构视图，其中数千个GBP1二聚体可能将其c端GED结构域延伸到280 ?，以锚定法尼基尾并插入附近的多基贴片。

这种中尺度外套在原位也很明显。聚焦离子束(FIB)研磨片层与相关光学和电子显微镜(CLEM)一起在人细胞内发现了gbp1包被的细菌(图S10, A至D) 扫描隧道显微镜^pBAD-ftsZ在150 ~ 300 nm的fib磨薄片层中检测罕见的包被事件，以及在GBP中检测EGFP-GBP1的表达 ^{Δ1 q22.2}背景确保它是唯一靶向杆菌的GBP家族成员(图S10A)。这种双重策略成功地解决了逃逸到胞质溶胶中经过clem验证的细菌上的GBP1外壳复合物;空泡的 扫描隧道显微镜缺乏EGFP-GBP1作为阴性对照(图S10, B至D，图S11, a和B)。在这种分辨率下无法描绘单个GBP1二聚体;然而，~30 nm的EGFP-GBP1边界周围 扫描隧道显微镜与无细胞测定中重组被膜的长度非常相似(图S11A)。因此，在体外观察到的构象变化可能在细胞中起作用，产生了大量的GBP1防御复合体。

GBP1防御复合体装配构象动力学模型

通过三种不同的方法进一步验证了人GBP1的构象动力学模型。首先，我们设计了顺序洗涤条件，以减少蛋白质在外壳复合体内部的拥挤。它使我们能够观察到分离的GBP1二聚体仍然附着在 扫描隧道显微镜体外omv和微型细胞( 图6、A、B，图S12, A和B)。66个分离的GBP1蛋白的断层扫描图像发现，所有的GBP1蛋白都有球状的LG位于周长，延伸的C端锚定在底部;这些分离的二聚体跨度为25.08 ~ 27.44 nm，表明其构象扩展了( 图5,D至F，图S12, C和D)。其次，纳米金标记验证了这一取向。我们选择1.8 nm的ni - nta纳米金颗粒结合组氨酸标签(His) ₆)融合到GBP1的n端LG，用于检测其在成熟外壳内的位置。标签只在外边界( 图6 c)，这与LG位于外套的顶部是一致的，正如分离的二聚体( 图6、A、B)。值得注意的是，在没有His的情况下，暴露的细菌OM不能结合纳米金颗粒 ₆-GBP1，表明标记信号来源于蛋白质本身( 图6 c)。试图引入一个函数His ₆由于存在用于法尼化的CaaX基序和用于OM锚定的多碱基R584至586A序列，因此在GBP1 C端附近的序列被证明是不切实际的。尽管如此，洗净的omv和纳米金标记的冷冻- et都证实了GBP1二聚体在革兰氏阴性细菌表面的长度和方向。

最后，通过半胱氨酸替代试验评估了GBP1 GED动态开放的要求。七个配对的半胱氨酸(Cys)突变体(I369C-E533C、E366C-G530C、I365C-H527C、R362C-E526C、I365C-G526C、G361C-S523C和G389C-K520C)跨越c端GED α12螺旋及其空间相邻的α7 MD螺旋，实现了“封闭”构象的二硫交联(图S13A);这阻止了c端α12,13区域打开到~280 ?，除非暴露于还原剂如二硫苏糖醇(DTT)。为了确保引入Cys-Cys对不会导致除打开c端铰链外的总体结构改变，我们首先测试了它们是否仍然可以靶向 扫描隧道显微镜在人类细胞质的还原环境中。所有7对Cys-Cys包被细胞质 扫描隧道显微镜HeLa细胞(图S13B)。在这些突变体中，我们选择了Cys-Cys间键长度最短的中间R362C-E526C突变体(2 ?)，在原位确认其正常活性后，制作重组RFP-GBP1进行直接无细胞包衣实验( 图6、D、E在没有DTT的情况下，“封闭”的二硫化物连接的R362C-E526C构象完全不能涂覆 扫描隧道显微镜即使给予GTP底物，与野生型rRFP-GBP1对照( 图6 f)。然而，添加DTT完全恢复了R362C-E526C突变体( 图6 f)。因此，生化证据支持人类GBP1二聚体需要动态打开至~280 ?才能在细菌表面组装。C15法酰化的尾部将GBP1锚定在OM上，催化LG结构域位于边缘，以产生这种独特的宿主防御平台。

讨论

高阶蛋白组合有助于放大先天免疫信号，并通过在配体识别位点定位伙伴来在空间上调节信号传播(1,3)。这种组合形成于宿主质膜、线粒体、过氧化物酶体和叶绿体上(1,48)。它们也发生在细胞质、细胞核、内质网和内体网络中，在某些情况下，通过液-液相分离产生无膜凝聚物(49)，正如最近在细胞自主防御细菌植物病原体过程中发现的植物gbpl(7,8)。

相比之下，人类的GBP1在一个完全陌生的物体，革兰氏阴性细菌OM上构建了一个多蛋白复合物。这个巨大的纳米机器将GBP2、GBP4、caspase-4和全长GSDMD作为一个六成员平台的一部分，在多种人类细胞类型中传播细胞因子和细胞死亡信号( 10， 16)。我们发现人类GBP1是这个平台的中心组织者，并像DLP超家族的其他成员一样，利用核苷酸依赖的水解来自组装( 18)。gtp驱动下的GBP1协同性呈s型曲线 扫描隧道显微镜在125 nM以上急剧加速的细菌上的涂层曲线，类似于其他“优先化”蛋白质，一旦达到浓度阈值，就会发生全或无反应( 3)。锚定在LPS上可能有助于加速GBP1的催化和寡聚( 16)。GTPase和GDPase活性都通过GTP和GDP的转换(作为两步酶促过程的一部分)来促进GBP1的响应性( 15， 21)。由于GTP和GDP的水解释放了大量的吉布斯自由能，因此GBP1外壳通过“做功”来建立这个巨大的信号平台，从而符合纳米机器的要求。这也许可以解释为什么像GDP这样的过渡状态类比。如果 ₃ ^{- - - - - -}不能在完整的细菌上重现原生被毛( 15)，尽管它能帮助GBP1形成二聚体( 20， 21)。相反，需要多轮GTP和GDP水解来持续驱动相邻二聚体的组装，这些二聚体可能经历横向相互作用以稳定涂层。Cryo-ET表明，这些横向相互作用可能是由gtp诱导的扭曲LG本身的变化引起的，因为GBP1二聚体在嵌入天然外壳复合物时表现出轻微的不对称。

GTP水解的功能重要性被其触发gbp1依赖性LPS释放的能力进一步加强，后者激活caspase-4并使细菌对apol3介导的杀伤( 13)。同样，过渡状态(GDP)。如果 ₃ ^{- - - - - -}, GMP。如果 ₄ ^{- - - - - -})或不可水解的类似物(GTPγS或GMPPNP/GppNHp)未能引起gbp1依赖性的OM破坏以释放LPS。这些结果强调了使用底物模拟物来探测GBP1防御复合物在病原体表面的形成和功能的局限性，尽管它们在早期分离的GBP1研究中很有用( 20， 21， 24）.

Cryo-ET为我们提供了关于GBP1及其在革兰氏阴性上的超分子结构的结构信息 沙门氏菌表面处于自然状态。先前的GBP1晶体结构使用的是在 大肠杆菌捕获单体(载脂蛋白)状态±GMPPNP ( 20， 22)。细菌中产生的n端g结构域在多个不可水解核苷酸(GMPPNP, GDP)存在下也结晶为同二聚体。如果 ₃ ^{- - - - - -}, GMP。如果 ₄ ^{- - - - - -}、及GMP) ( 21)。两种全长的人GBP1晶体结构都将α12和α13 GED螺旋折叠在α7和α11 MD上，而在天然条件下，我们发现在人细胞中产生的重组GBP1是完全拉伸的，α12和法酰化的α13螺旋垂直插入细菌的外小叶。确定一个“开放的”GBP1构象作为成熟外壳复合体的主要重复单元，加强了冷冻- et的能力，以深入了解组装蛋白质在其天然膜目标上和天然底物存在下的行为，在这种情况下，底物是GTP ( 50）.

我们试图解决组装在其生理表面上的GBP1防御复合物的尝试在两个尺度上证明是具有挑战性的:首先，GBP1二聚体的小尺寸(~140 kDa)，其次，最终聚合物的大尺寸~1.5 gda。在数千个相同的蛋白中确定单个GBP1分子的长度和取向为9.7 ?不仅得益于获取后掩蔽，还得益于细菌遗传学和重组蛋白制备。纯化的150- 300纳米微细胞和厚度减少的omv有助于提高倾斜图像的质量。进一步通过基因去除o抗原和外核来防止非结构化LPS密度干扰GBP1 c端分辨率( 45)。部分隐藏在内部小叶中的GBP1的GED可以从断层扫描中重建，以帮助确认动态开放模型。使用快速蛋白液相色谱(FPLC)直接从人细胞中纯化的法尼化GBP1也确保了正确的OM锚定和插入。C15脂化需要通过人法尼基转移酶进行顺序添加，通过CAAX羧化肽酶去除三肽，然后通过异戊酰半胱氨酸羧化甲基化酶( 32)。因此，后戊烯基加工使完全修饰的法尼基尾部几乎与三精氨酸贴片相邻(相距三个氨基酸)，形成强大的两部分锚。多基基序的OM插入可能与带负电荷的PO发生静电相互作用 ₄ ^{- - - - - -}脂质A基团和内核糖，而法尼基化使尾部更疏水( 15， 16)。总之，这些修饰使人GBP1的STA与革兰氏阴性细菌结合。现在我们已经建立了检测纤维素中gbp1包被细菌的初始条件，它应该有助于注释fib研磨的人细胞的层析密度。

我们的低温et三维重建阐明了一种独特的宿主防御结构的中尺度结构，即大量的GBP1外壳复合物，它在人类细胞质内的微生物病原体表面协同起作用。我们的研究结果加强了高阶蛋白质组装在动植物先天免疫系统中的重要性。这些纳米机器浓缩信号和效应蛋白，用于快速动员细胞自主抵抗感染。

材料与方法

抗体和试剂

抗体

使用的抗体有抗flag M2 (F1804, Sigma)、抗ha (16B12, Biolegend)、抗myc (9E10, ThermoFisher)、抗gfp (11814460001, Roche;A0174, Genscript)，抗gst (1E5, Origene)，抗dsred (sc-390909, SCBT)，抗gbp1 (sc-53857, SCBT)，抗gbp2 (sc-10581, SCBT)，抗- 沙门氏菌O B组抗血清(240984,BD)、抗鞭毛蛋白(flic1, biolgend)、抗β-肌动蛋白(ab6276, Abcam)、抗gapdh 41335;SCBT)，抗il -18 (PM014;MBL)，抗caspase-4(克隆4B9;Enzo)和抗gsdmd (NBP2-33422, Novus Biologicals)。应用见表S1。

试剂

GTP钠盐(G8877)、GTP-γ-S(四锂盐;G8634)， GDP钠盐(GDP;G7127)、GMP钠盐(GMP;G8377)，三氟化铝(449628)，氯霉素(220551)，Ficoll (F5415)和生物素(B4501) (Sigma /微孔);鸟苷-5′-[(β，γ)-亚胺]三磷酸(四锂盐)/GMPPNP/GppNHp (Jena Biosciences;ν- 401 - 50);重组人IFN-γ (285-IF/CF;研发系统;285——如果); 明尼苏达州沙门氏菌LPS-Alexa Fluor 488 (ThermoFisher;L23356)。

菌株

细菌菌株由内部产生或由以下组提供: 美国血清血清型鼠伤寒( 扫描隧道显微镜)菌株1344和鞭毛蛋白缺乏 扫描隧道显微镜 ^Δ ^flhD (Dr. Jorge Galan); 扫描隧道显微镜UK-1野生型，Δ wzy,Δ 瓦尔,Δ waaJ,Δ waaI,Δ waaG,Δ lpxR,Δ pagL,Δ pagP， χ11088 ( 扫描隧道显微镜 ^{ΔlpxRΔpagLΔpagP}三重突变体)(Roy Curtiss III博士，Soo-Young Wanda博士)( 38， 40）; 铜绿假单胞菌L2菌株(Barbara Kazmierczak博士) 枯草芽孢杆菌(法伦·艾萨克斯博士) l . monocytogenes140203S (Herve Agaisse博士)。

以下 扫描隧道显微镜菌株在1344等基因背景上构建: 扫描隧道显微镜 ^Δ心， 扫描隧道显微镜^pBAD::ftsZ， 扫描隧道显微镜^{mreB (K27E)}， 扫描隧道显微镜^{mreB (D78V)}， 扫描隧道显微镜^mScarlet-I, 扫描隧道显微镜^eGFP．此外, 扫描隧道显微镜。 ^{ΔWaaG::pBAD-ftsZ}在UK-1背景下为cryo-ET生成。详见表S2。

生成 扫描隧道显微镜对UK-1中的MinD缺失和MinD/waaG双缺失突变体，采用lambda红色重组酶系统。引物minDKO-L (GTTTACGATTTTGTAAACGTCATTCAGGGCGATG cgactgtgtaggctggggcttcccc)和minDKO-R (ggagatgttcttaatcggttcttcccc attttctcatgggaattagccatggtccccgcccca)扩增出具有minD侧翼序列的卡那霉素卡带）以pKD4矢量为模板。将聚合酶链反应(PCR)产物凝胶提取并电穿孔至野生型UK-1和waag缺失型UK-1 扫描隧道显微镜受体细胞表达红色重组酶。选择卡那霉素(Km)耐药菌株，采用minD Km插入验证引物minD-Km- l (ATTTTGTAAACGTCATTCAGGGCG)和minD-Km- r (gcagttcattcagggaccg)检测卡那霉素插入minD基因。使用引物minD- wt - l (GCTGATCAAAGATAAGCGTACTGA)和minD- wt - r (CGATGCCAGAATACCCAG AATACG)检查minD缺失区域。

细胞培养和转染

HeLa (CCL-2)和293T (CRL-3216)细胞购自American Type Culture Collection (ATCC)。细胞在添加10% (v/v)热灭活胎牛血清(FBS)的DMEM中生长，37℃，5% CO ₂孵化器。慢病毒(LentiCrisprV2;附加基因质粒#52961)或逆转录病毒(pMSCV-puro;转染的293T细胞经0.45 μm过滤的上清液用8 μg/mL聚苯乙烯孵育24小时，完成Takara 634401)的转导。为选择稳定的转导剂，以1 μg/ml嘌呤霉素为标准。对于瞬时转染，反式它 ^?-LT1 (MIRUS;MIR 2300)按照制造商的说明使用。为了尽量减少显微镜实验中的毒性，每24孔盖滑动转染200 ng DNA。用500 ~ 1000 U/mL IFN-γ刺激HeLa细胞18小时。

CRISPR-Cas9细胞系与稳定互补

为了在HeLa CCL2细胞中产生稳定的基因敲除，按照既定的方案将单引导rna (sgRNAs)克隆到pX459 (Addgene质粒#62988)中。每个基因靶向2 ~ 4个sgRNAs(总DNA为200 ng)转染24孔板，用1 μg/mL嘌呤霉素筛选48小时。将存活细胞在不含嘌呤霉素的培养基中扩增48小时，然后进行有限稀释以获得单个菌落。先用PCR法筛选菌落，再用Western blot法筛选，每个阳性克隆用Sanger测序法确定基因型。产生了以下10个CRISPR-Cas9突变体 ^{- / -}, 2英镑 ^{- / -}, 3英镑 ^{- / -}, 4英镑 ^{- / -}, 1英镑 ^{- / -}2英镑 ^{- / -}双突变体，GBP ^D1q22.2七重突变体 ^{- / -}2英镑 ^{- / -}3英镑 ^{- / -}4英镑 ^{- / -}5英镑 ^{- / -}6英镑 ^{- / -}7英镑 ^{- / -}), CASP4 ^{- / -}, GSDMD ^{- / -}, AOAH ^{- / -}， RNF213 ^{- / -}．表S3提供了用于产生这些CRISPR缺失的向导rna (grna)的完整列表。

此外，我们生成了一系列细胞系，稳定或短暂地补充了GBP突变体、亲和探针或报告基因。包括GBP1 ^{- / -}克隆系补充以下任一:EGFP-GBP1、RFP-GBP1、mg - gbp1、EGFP-GBP1 ^S52N, EGFP-GBP1 ^DD103,108NN, EGFP-GBP1 ^D184N, EGFP-GBP1 ^C589S, EGFP-GBP1 ^{α的arr 13}, EGFP-GBP1 ^{α13 rar}, EGFP-GBP1 ^α13基本, EGFP-GBP1 ^{α13 ara}, EGFP-GBP1 ^{α13 aar}, EGFP-GBP1 ^{α13 aaa}(r584 - 586 a)。本文根据Stratagene Quickchange (Agilent 200523)协议，引入了GBP1 c端多碱基贴片(氨基酸584 ~ 586)的丙氨酸扫描突变，并通过DNA测序进行了证实。质粒转染到GBP1进行互补 ^{- / -}根据制造商协议，使用Mirus LTI对海拉细胞进行检测。简单地说，将1 μL的Mirus LTI加入到50 μL无血清DMEM中，然后分别加入500 ng的构建物。将混合物静置30分钟，然后通过移液轻轻混合。在耐嘌呤霉素的GBP1上选择耐潮霉素的细胞 ^{- / -}海拉细胞背景。

我们也补充了CASP4 ^{- / -}EGFP-caspase-4和GSDMD ^{- / -}EGFP- FL-GSDM, EGFP- nt - gsdmd或EGFP- ct - gsdmd。后一种质粒也被引入CASP4 ^{- / -}和1英镑 ^{- / -}荧光显微镜下的无性系见上图。

细菌感染，LDH测定，和IL-18 ELISA

为 扫描隧道显微镜在新鲜Luria肉汤(LB;Thermo 12780029)，培养3小时，然后在PBS中洗涤一次，用于在80%的合度下感染HeLa细胞，感染倍数(MOI)为20至50，如图所示。1000倍离心10分钟 g在37°C下孵育30分钟，以使细胞浸润。用含有100 μg/ml庆大霉素(Thermo 15710064)的新鲜DMEM (Thermo 11965092)替代培养基，杀死细胞外细菌30 min。细胞洗涤3次，并用20 μg/ml庆大霉素孵育。为了枚举活菌，细胞在PBS + 0.5% Triton X-100中裂解，并在LB琼脂上连续稀释。LDH测定采用CytoTox 96?非放射性细胞毒性测定法(Promega G1780)测定细胞死亡。采用人IL-18酶联免疫吸附测定试剂盒(Abcam;ab215539)，检测灵敏度为8.3 pg/mL。

点击化学和代谢标记

法尼基焦磷酸(FPP) -叠氮化物-生物素CLICK化学

表达GFP或GFP- gbp1突变体构建的293E细胞(ATCC HEK CRL-1573)以2 × 10的倍率被镀 ⁵六孔板中每孔中的细胞。然后用20-μM Azido farnesyl焦磷酸(Cayman C10248)处理细胞18小时，然后用500 μL 20- mm Tris(7.5)、100-mM NaCl、1%含有罗氏蛋白酶抑制剂的TX-100缓冲液裂解细胞。细胞进一步在冰上超声(30%功率Virtis Virsonic 600，每次1分钟3次)，以释放膜结合蛋白。裂解物在21000℃离心 g将上清液转移到新的Eppendorf管中，在室温黑暗条件下，用100-μM Biotin dibenzocyocytynol (Thermo C10412)处理过夜。每个IP中加入1 μg罗氏单克隆抗gfp抗体，4℃孵育2小时。在每个反应中加入20 μL预平衡的Protein G Sepharose (Cytiva 17-0756-01)，再加2小时。珠子在4000度时成球 g5分钟后在裂解缓冲液中冲洗8次。加入100 μL的2X SDS-Sample Buffer洗脱样品，100℃加热20 min进行免疫印迹。用链亲和素hrp和罗氏抗gfp进行免疫印迹。

KDO-azide铜^{2 +}自由点击化学

日志阶段的KDO 扫描隧道显微镜根据生产商说明书(耶拿生物科学)，用点击介导法进行标记。简单地说，引入双正交叠氮基团对KDO的c8位进行叠氮修饰，以防止KDO-8- p磷酸酶的反向代谢。这种8-叠氮-8-脱氧- kdo修饰使DIBO烷基染料中间体(Jena Bioscience CLK-A105P4)中的生物素基团通过Cu(I) free CLICK化学引入，以添加Alexa Fluor 594标签(Jena Bioscience CLK-1295)。在感染实验中，我们对已经将荧光标记的d -丙氨酸结合到肽聚糖支架中的细菌进行点击化学反应，使用500 μM的hcc -氨基- d -丙氨酸(HADA;多国评价hy - 131045)。未掺入的DIBO通过PBS大量洗涤去除。

Stm肽聚糖代谢标记及脂多糖在纤维素中的释放

荧光蓝色或红色d -丙氨酸类似物[hc -氨基- d -丙氨酸，HADA (MCE hay -131045);TAMRA 5-氨基- d -丙氨酸使用5-羧基四甲基罗丹明(ab145438)]按描述( 46)。MOI 20时HeLa细胞感染。感染40 min后改为DMEM加100 μg/mL庆大霉素，1 h后改为30 μg/mL庆大霉素。感染后2小时用PFA固定细胞，对GBP1或LPS进行免疫染色。使用DeltaVision采集至少10个gbp1阳性和10个gbp1阴性视野 ^TMOMX SR Blaze显微镜系统(GE Healthcare)， 3D-SIM模式(512 × 512像素，曝光1毫秒，125纳米步进，8 z片，每片15张图像)。所有图像都经过宽视场图像、反卷积和最大强度投影处理，以便在CellProfiler中进行半自动分析(Broad Institute, Open Scholar, 2021)。

显微镜

3D-SIM和多色共聚焦显微镜

HeLa细胞在12 mm高性能覆盖玻璃(Thorlabs CG15KH1)上生长1.5h，用于固定样品的显微镜观察。为了进行实时成像，将细胞接种在四孔室(Cellvis C4-1.5H-N)上，使用1.5高性能覆盖玻璃。在这里，播种发生在成像前48小时，在感染当天达到80%的融合度。成像前给予IFN-γ治疗18 - 24小时。在MOI为20的情况下，将细菌添加到感染细胞中。图像在一台三角电视机上进行分析 ^TMOMX SR Blaze显微系统(GE Healthcare)或激光扫描共聚焦模型SP8(徕卡)。

对于超快实时成像，GBP1 ^{- / -}用RFP-GBP1转染HeLa细胞，用1000-U/mL IFN-γ诱导18小时，然后用EGFP-感染 扫描隧道显微镜在MOI 20。40分钟后，将培养基改为含有30 ug/mL庆大霉素的DMEM，并在感染后60分钟开始在37°C, 5% CO下成像 ₂．使用OMX-SR Blaze显微镜(GE)在3D-SIM 512 × 512像素模式下，以~180帧秒的速度每45 s采集一次图像 ^?1．图像表示云纹条纹图案反卷积z堆栈的最大强度投影(Softworx, GE)。使用Imaris(牛津仪器)软件进行实时体素(盒装)组装事件的采集后计算。结合使用Voronoi细胞算法计算的GBP1 (PDB ID 1F5N)和RFP (PDB ID 1GGX)的三维原子结构体积( http://proteinformatics.org/voronoia)，计算每体素中空间受限RFP-GBP1分子的总数，以及涂层动力学。欧氏Voronoi细胞算法能够估计沉积蛋白质结构(PDB)中所有原子的堆积密度，计算原子的范德瓦尔斯球内的体积，原子的溶剂排除体积，以及蛋白质中可以容纳水分子的每个空腔的位置和近似半径，从而获得完整的体积信息( 51)。此外，还包括了3D-SIM荧光对gbp1包被细菌的EM体积的补偿比，因为前者不能以与EM相同的精度分解物体。3D-SIM体积平均大3.02倍( n= 17)，比直接免疫电镜测量值高。因此，将3D-SIM体积除以3.0以校正荧光增强。长期成像采用低光OMX-SR常规模式，以5分钟间隔连续记录长达2.5小时(图S3C)。

用于检验GBP-COAT ^{450 - 708}我们构建了不同光谱范围的荧光融合蛋白GBPs1-4、caspase-4和GSDMD，以同时容纳5个或6个蛋白 扫描隧道显微镜．将6个外壳蛋白分别与以下荧光报告蛋白融合，生成60个蛋白的彩色编码矩阵:mAzurite- c1 (Addgene质粒#54583)、mt -蓝宝石-c1 (Addgene质粒#54545)、pmTurqouise2-c1 (Addgene质粒#60560)、pmEmerald-c1 (Addgene质粒#53975)、pmVenus-c1 (Addgene质粒#27794)、pmmorange -c1 (Addgene质粒#54680)、pmKeima-Red-c1 (Addgene质粒#54546)、pmCardinal-c1 (Addgene质粒#54546) ^{# 54799})， pmApple-c1(添加基因质粒#54631)和mIFP24-c1(添加基因质粒#54820);E _x/ E _米范围:384/450至684/708 nm。简而言之，从ifn α处理的HeLa细胞cDNA中分别扩增出GBP1、2、3和4引物。用Caspase-4 cDNA (Sino Biologicals #HG11158-M)和pET-SUMO-hGSDMD (Addgene，质粒#111559)的引物分别扩增Caspase-4和GSDMD。扩增子被克隆到报告质粒中萨尔我/ BamHI限制性内切酶消化。对所有构念进行测序以进行验证。多阵列测试发现pmIFP24-GBP1、pmOrange-GBP2、pmvenous - gbp3、pmEmerald-GBP4、Sapphire-caspase 4或-GSDMD的五种组合，或pmOrange-GSDMD可以成功地与 扫描隧道显微镜．

GBP-COAT ^{450 - 708}根据制造商的说明，用转染试剂(Mirus Bio)将组合转染到GBPD1q22.2七倍突变体中。24小时后，用IFN-γ激活细胞16 ~ 18小时，并用spi1诱导的病毒感染细胞 扫描隧道显微镜SL1344在MOI = 5~10条件下孵育30 min，再与100 μg庆大霉素孵育50 min，以消灭胞外细菌。用激光扫描共聚焦显微镜(SP8, Leica)捕捉五色或六色荧光图像。如图S4E所示，使用一系列激光器来激发这个宽波长的荧光，并避免漏出。所使用的相应激光参数(激光、%功率、波长接收波段)为:pphire(二极管405、4、424 ~ 444)，pmEmerald(二极管470、20;490至520)，金星(WLL 516,6;pmOrange (DPSS 561, 25,566至593)，pmIFP24 (HeNe 633, 75,680至730)。利用LAS X软件(徕卡)对图像进行三维重建。

4 pi-sms nanoscopy

对于4Pi- sms成像，使用一种定制的显微镜，在两个相对的高na物镜周围建立一个垂直的4Pi腔，如其他地方(28)详细介绍，用于捕获IFN-γ激活的HeLa细胞中GBP外壳复合物的高分辨率图像。细胞样品在直径为25mm的圆形精密玻璃盖片(Bioscience Tools, San Diego, CA)上制备，浸入1M KOH中，并在超声波清洗机(2510 Branson, Richmond, VA)中超声15分钟。在milliq水(EMD Millipore, Billerica, MA)中依次洗涤，并用70%乙醇消毒，然后干燥并将盖子涂上聚赖氨酸。在4%多聚甲醛(PFA)中固定前，HeLa细胞在盖片上生长24至48小时。Anti-GBP1 (1 b1;圣克鲁斯;1:500稀释)和GBP2 (1E5;Origene;1:200稀释)抗体在室温下用山羊抗小鼠Fab AF647 (Jackson ImmunoResearch, PA)和山羊抗兔IgG CF660C (Biotium, CA)在1:200稀释下标记2小时。

1B1抗体针对全长GBP1蛋白，而抗gbp2抗体针对一个n端17个氨基酸的肽表位。这使得两种抗体都能结合它们的内源性GBP靶标，因为n端LG指向外壳复合物的顶部。特异性在IFN-γ活化中得到证实 ^{Δ1 q22.2,英镑}1英镑 ^{- / -}或2英镑 ^{- / -}HeLa细胞作为阴性对照:所有细胞在单分子水平上未标记。利用这种技术，至少可以在胞质细菌上检测到几百个GBPs，通常是400到800个分子。虽然这个数字在无细胞系统中只占cryo-ET枚举的总数的2%到3%，但当1B1抗体染色用于无细胞的gbp1包被细菌时，它给出的数字同样很低。因此，抗体可及性(由于被膜的致密性)和较大的二抗检测是限制因素。目前市面上还没有用于GBP1或GBP2的纳米体。然而，值得注意的是，与体外相比，这种比较忽略了在纤维素中具有较少GBP外壳蛋白的细菌，因为当用相同的多克隆抗体标记时，两者的结果相似。

样品安装、图像采集和数据处理主要按照前面描述的方法进行( 29成像速度为200 Hz, 642 nm激光强度为~12.5 kW/cm ²．通常，记录3000×100~200帧。DME用于漂移校正。使用Vutara SRX 7.0.06软件(Bruker, Germany)，采用点飞溅模式(20 nm粒径)绘制所有4Pi-SMS图像。

重组蛋白的纯化

GBP1到GBP4及其突变体caspase-4^C258ARFP-AtGBPL1

将人GBP1及其突变体的编码序列克隆到定制载体pCMV-His中 ₁₀-Halo-HRV-mRFP-TEV用于涂层分析。HEK 293F悬浮细胞(James Rothman博士的礼物;支原体阴性)浓度维持在0.4 × 10 ⁶~4 × 10 ⁶细胞/m在Expi293表达培养基(ThermoFisher A1435101)中。转染前24小时，以1.2 × 10的浓度接种细胞 ⁶细胞/毫升。转染时，收集细胞，在2.5 × 10浓度的新鲜培养基中重悬 ⁶细胞/毫升。加入pCMV-His转染细胞 ₁₀在含PEI浓度为5 μg/ml的培养基中，含halo - hrv - mrfp - tev的克隆终浓度为1 μg/ml。转染24小时后，用含有4-mM丙戊酸的新鲜培养基1:1 (v/v)稀释细胞，再培养2天。2 × 10 ⁹通过离心(500倍)收集细胞 g， 10分钟)，在冷PBS中洗涤一次，在裂解缓冲液(50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl)中重悬 ₂， 10%甘油，0.5% CHAPS, 1mm TCEP)，通过超声裂解。细胞在35000倍下被清除 g在4℃下放置1小时。收集上清液，与1 ml床体积的HaloLink树脂(Promega G1912)在4°C下缓慢旋转孵育过夜。用洗涤液1 (50-mM HEPES, pH7.5, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl)依次洗涤树脂两次(每次10分钟) ₂(10%甘油，0.5% CHAPS)，洗涤缓冲液2 (50 mM HEPES, pH7.5, 1m NaCl, 10%甘油)，然后洗涤缓冲液1。

为了洗脱结合蛋白，Halo树脂在裂解缓冲液中重悬，用自制的GST-HRV-His蛋白酶在4°C下缓慢旋转消化过夜。将树脂制成颗粒，通过Ni-NTA珠亲和层析(QIAGEN 30210)从上清液中去除HRV蛋白酶。通过收集、浓缩、进一步纯化和缓冲交换，通过尺寸排除色谱(Superdex?200 Increase;GE Healthcare)用储存缓冲液[20 mM HEPES (pH 7.5)， 150 mM NaCl, 1 mM MgCl]平衡 ₂[1 mM TCEP]。馏分经SDS-PAGE分析，混合、浓缩并在液氮中快速冷冻，然后在-80°C保存。rRFP-tev-hGBP1(简称rRFP-hGBP1)蛋白浓度通过BCA和SDS-PAGE电泳测定，BSA标准品备用。

重组人GBP1、GBP2、GBP3和GBP4以及GBP1突变体(hGBP ^{1 s52n}, hGBP1 ^D184N, hGBP1 ^DD103,108LL, hGBP1 ^C589S和hGBP1 ^R3A)，分别克隆到哺乳动物表达载体pCMV-3Tag1A (Agilent 240195)中，带有n端FLAG标签。人类caspase-4 ^C258A克隆到pcDNA 3.1/Hygro (Thermo V87020)中，用于n端FLAG连接。质粒通过Mirus LT1转染到HEK-293 E细胞中。14小时后收获细胞，在50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl缓冲液中裂解2小时 ₂1 mM DTT，含1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂。含有表达蛋白的上清液通过抗Flag M2亲和凝胶(Sigma A2220)，结合的Flag蛋白用Flag肽150 μg/mL洗脱，缓冲液为50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂和1mm DTT。在AKTA FPLC (GE Amersham)仪器上进行进一步的色谱纯化。所有在人细胞中制备的重组蛋白均经LAL (ThermoFisher A39552)检测，证实不存在LPS污染(<0.01 EU/mL，最低检出限)。

粒径排除色谱法

他的。 ₆-标记的GBP1或GBP1突变蛋白按上述方法制备。FPLC在配备Superdex 200 10/300 GL尺寸排除柱(GE Amersham)的AKTA系统上进行。用5个体积当量的缓冲液[20 mM Tris (7.5)， 140 mM NaCl, 2 mM MgCl]预平衡柱后 ₂]，检测各重组GBP1蛋白100 μg。然后用20 mM Tris (7.5)， 140 mM NaCl, 2 mM MgCl交换和平衡柱缓冲液 ₂，内含200 μM GDP-AlF ₄ ^{- - - - - -}在过渡态模拟物存在的情况下测试GBP1组装。在280 nm处测量吸光度，并在保留时间内生成色谱仪。

薄层色谱法

薄层色谱(TLC)用于分离GTP、GDP和GMP，并完全按照前面所述( 7- - - - - - 9)。简而言之,α- ( ³²P]GTP (Perkin Elmer BLU006H250UC)在反应缓冲液中水解[20 mM HEPES (pH 7.0)， 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl] ₂， 100 μM GTP, 10 μCi α-( ³²P) GTP]在25℃下测定，反应7小时后用142 mM EDTA淬火。所得产物采用PEI纤维素(Sigma, Z122882)，荧光指示剂(UV 254)，用750 mM KH进行分离 ₂阿宝 ₄(pH 3.5)作为溶剂，通过放射自显影。

LAL用于OM破坏试验中脂质A检测

Overnight-cultured 扫描隧道显微镜与指定抑制剂在37°C下摇匀预孵育2小时。3500转/分钟室温离心20分钟后，用10倍体积的涂膜缓冲液[50 mM HEPES (pH 7.5)， 150 mM NaCl, 1 mM MgCl]洗涤3次 ₂最后用含GTP (2mm)、GTPγ s (2mm)、GMPPCP/CppCp (10mm)、GDP的涂布缓冲液(1ml)重悬。如果 ₄ ^{- - - - - -} (2?mM GDP, 200?μM AlCl ₄(10mm NaF)或GMP。如果 ₃ ^{- - - - - -} (2?mM GMP, 200?μM AlCl ₃， 10 mM NaF]。用或不加4 μM重组GBP1或其突变体在30℃下孵育1小时。仔细收集上清液，离心(8000 rpm, 22°C, 2 min)，稀释1:1000至1:5000。释放的LPS采用毒素传感器显色LAL内毒素测定试剂盒(GenScript L00350)，按照生产厂家说明进行测定。

LPS-binding化验

人类GBP1, GBP2, GBP3, GBP4, GBP1突变体(GBP1 ^S52N, 1英镑 ^D184N, 1英镑 ^DD103,108LL, 1英镑 ^R53A，以及GBP1 ^C589S)和caspase-4 ^C258A这些蛋白在人胚胎肾(HEK)-293E细胞中表达为Flag标记蛋白，并使用上述Flag M2珠从大规模贴壁细胞培养中分离出来。重组人蛋白进一步用FPLC纯化为单峰。在37°C下，在不同GBP浓度的结合缓冲液[50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl]中进行荧光各向异性测定 ₂， 0.3 mM GDP和AlF _X (10 mM NaF, 0.3 mM AlCl ₃)， pH 7.0]和Flag- caspase-4 ^C258A(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.0)浸泡15分钟，然后加入 沙门氏菌明尼苏达州LPS-Alexa Fluor 488至终浓度250 nM。LPS孵育1小时后，用SpectraMax i3x (Molecular Devices)测量荧光各向异性值。

重组涂层试验

野生型 扫描隧道显微镜和 扫描隧道显微镜突变体在LB板上新涂上条纹。单个新鲜菌落在LB培养基中37℃培养过夜。在包衣试验之前，将细菌在新鲜LB培养基中稀释1/60，再培养2小时，离心(4000)收获 g， 22°C下5分钟)。为了去除抑制rRFP-hGBP1靶向的脱落LPS，细菌在涂膜缓冲液[50 mM HEPES (pH 7.5)， 150 mM NaCl, 1 mM MgCl]中洗涤两次 ₂]并进一步稀释到光密度(OD) ₆₀₀)在涂层缓冲液中为0.1。涂布前立即在室温下解冻rRFP-hGBP1，并在12,000℃下离心 g浸泡15分钟，去除不溶性聚集体。包衣时，在每0.1 OD的细菌中加入2 μM rRFP-hGBP1和2 mM GTP，轻轻混合，在22℃下孵育1小时后成像。

为了对rrfp - hgbp1包被的细菌进行成像，将包被反应(20 μL)转移到384孔玻璃底板(Cellvis;p384 - 1.5 h - n)。该板在2000℃离心 g1分钟将所有液体收集到井底。所有图像均采用徕卡SP8激光扫描共聚焦显微镜，63×/1.40油浸物镜。焦平面设置在井底。RFP在561 nm处激发，590 ~ 610 nm处检测。光学切片以共聚焦模式(1 Airy单位)获得，平均扫描6次。图像采集格式为512 × 512。使用FIJI/ImageJ进行图像分析。

对于涂层复合物组装，样品从2 μM rRFP-GBP1开始加倍稀释，直到涂层消失，建立涂层曲线。用最佳拟合插值绘制了观察到的行为，并出现了一条s型曲线。使用graphpad Prism 9.1.1进行曲线拟合并进行回归分析，得到半最大值和Hill斜率值。

重组杀虫分析

对于细菌杀灭试验， 扫描隧道显微镜在LB培养基中生长至中对数相，洗涤后用5 μM hGBP1在涂膜缓冲液(50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂)含或不含2mm GTP, 2mm GTPγ s或GDP。如果 ₄ ^{- - - - - -} (2?mM GDP, 200?μM AlCl ₃， 10毫米NaF)。 扫描隧道显微镜然后在含有5 μM rAPOL3的缓冲液A [50 mM MES pH 6.0, 100 mM葡萄糖酸钾(KGluc)]中制成球团并重悬，在37°C下孵育1小时，然后镀在LB琼脂上计数集落形成单位(CFU)，一式三份。

体外相分离

rRFP-GBP1和rRFP-GBPL1 ( 7)，室温解冻，14000 ×离心 g静置5分钟，去除任何聚集的蛋白。将蛋白稀释到低盐缓冲液(50 mM HEPES, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl)中诱导形成液滴 ₂)与不同体积的无盐缓冲液[20 mM HEPES (pH 7.5)， 1 mM TCEP]混合，并在室盖玻璃(Grace Bio-labs)中使用Lecia SP8激光扫描共聚焦，放大倍数为63×/1.40。添加5、10、15和20% w/v的Ficoll对rRFP-GBP1没有影响。

电子显微镜

负染色电子显微镜

为了观察rRFP-GBP1在微型细胞上的作用，将100 μL微型细胞洗涤并溶解在HEPES缓冲液(pH 7.4)中至OD ₆₀₀等于0.1。将微细胞悬液与终浓度为2 μM的rRFP-GBP1在22°C下，在GTP存在或不存在的条件下孵育1小时。将混合物浓缩至10μL，进一步进行透射电镜观察。将5 μL RFP-GBP1包覆和未包覆的微型电池装入发光碳膜包覆的铜EM网(EMS, CF400-Cu-50)上静置1分钟。EM网清洗，用2%甲酸铀酰染色30 s。网格用滤纸(Whatman filter PAPERS 2;1002-090)，干燥1分钟。在JEOL1400 +电子显微镜下观察栅格，加速电压为80 kV。

Cryo-ET

在EM网格上进行细胞播种

电磁网格的预处理。电磁栅格(Quantifoil R1/4 gold 200 mesh, Q250AR-14)放置在18 mm上 ²盖玻璃已洗净，并储存在100%乙醇。然后将其置于玻璃底皿(Cellvis, 35 mm皿，20 mm微孔盖玻璃)中，用70%乙醇在22°C紫外线照射下处理10分钟。电镜网格用无菌除气水洗涤6次，然后用0.05 mg/mL I型胶原(Gibco, A10644-01)在37°C培养箱中处理60分钟，然后用除气/蒸馏水洗涤。胶原包被的网格在DMEM培养基中，在37°C、5% CO的培养箱中孵育过夜 ₂供进一步使用。

英镑的 ^{Δ1 q22.2}在10 cm培养皿中培养7个突变体，培养密度为4 × 10 ⁶每盘细胞数。将EGFP-GBP1质粒转染HeLa细胞，使用Mirus LT1试剂盒进行过夜表达。随后用PBS洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶- edta处理以使细胞脱离。分离的HeLa细胞离心，用DPBS缓冲液重悬，然后用40 μm尼龙网过滤器(Fisher Scientific, 22363547)过滤，以去除较大的碎片。将过滤后的HeLa细胞悬液转移到5 mL聚苯乙烯圆底管(康宁，352235)中，用细胞过滤帽进行FACS分选。gfp阳性细胞分选到收集管中，离心后重悬至最终细胞密度为2 × 10 ⁴DMEM中添加10%胎牛血清和100 μg/mL Pen Strep (Gibco, 15140-122)。将表达egfp - gbp1的细胞接种到预处理的EM网格上，进一步孵育过夜。对于感染试验， 扫描隧道显微镜^pBAD-ftsZ0.2% l -阿拉伯糖诱导，培养至OD密度 ₆₀₀1.0，在MOI 200感染。涂有英镑的电磁栅极 ^{Δ1 q22.2}HeLa细胞和细菌细胞进一步在800℃离心 g5分钟，将细菌旋转到HeLa细胞表面。电镜网格转移到37°C培养箱中再孵育20分钟，然后用DPBS洗涤三次，用完全DMEM加100 μg/mL庆大霉素再孵育1小时。

用于制备微型细胞 扫描隧道显微镜 ^?思想在LB培养基中添加100 μg/mL氨苄西林，37℃下培养过夜。将10 mL细菌过夜培养物加入1 L新鲜LB培养基中，在氨苄西林的存在下，培养到log期后期。然后分批培养在:(i) 6240下进行3步离心 g(Beckman coulter, Avanti JXN-26, rotor, JLA-8.1000) 10 min，去除亲本杆状杆菌;(2) 24820 g(转子，JLA-16.250) 10 min，收集微细胞组分，重悬于HEPES缓冲液(pH 7.4)中，用0.45 μm PVDF膜(Merck Millipore, SLJVM33RS)过滤;(3) 20000 g(转子，JA-25.50)再静置10分钟。将微孔组分调整至OD ₆₀₀1.0为rRFP-GBP1体外包被。

用于制备微型细胞 扫描隧道显微镜 ^{ΔwaaG::pBAD-ftsZ}新鲜培养物在含有100 μg/mL氨苄西林和0.2% l -阿拉伯糖的LB培养基中连续培养 FtsZ37℃诱导20小时。 扫描隧道显微镜 ^{ΔwaaG::pBAD-ftsZ}按照上述方法收集微型细胞。

玻璃化和低温相关荧光显微镜(CLEM)。

用荧光显微镜预先筛选表达egfp - gbp1的HeLa CCL2细胞的EM网格，夹在定制的手动柱塞上，用whatman# 1滤纸(GE, 1001-110)进行染色，并用柱塞将其冷冻在液态乙烷中。将冷冻网格转移到冷冻台上，并夹在o形环和c形环内(分别为ThermoFisher Scientific, cryo-FIB autogrid和c形夹)。Cryo-CLEM (Leica Microsystems EM Cryo-CLEM显微镜)按照前面描述( 7)。栅格被转移到与预冷航天飞机对接的Leica-CLEM筒中，然后转移到配备预冷40倍物镜的低温级上。一个奇迹 ×选取4个网格区域，对16个子区域进行成像。采用Z-stack模式，在0.35 μm的步进范围内获得蒙太奇egfp阳性图像。这个蒙太奇作为导航图，在随后的磨粉试验中通过聚焦离子束方法。

用FIB铣削薄片

将Cryo-CLEM划分的网格转移到配备冷冻级和冷冻转移穿梭系统的冷冻双束显微镜(Thermo Fisher Scientific, Aquilos冷冻fib聚焦离子束/扫描电镜)。薄片按照Aquilos冷冻fib方案制备。在网格o形环一侧的样品上溅射镀有铂(1 kV, 30 mA, 10 pa, 15 s)，以提高样品在FIB铣削过程中的导电性。在从cryo-CLEM导入荧光蒙太奇之前，使用MAPS软件在电子束模式下捕获EM网格蒙太奇，以生成合并图，以建立研磨片层的潜在目标。对目标区域的中心高度进行了细化，确定了片层的阶段倾斜角为16°。在网格上的目标位置，用气体喷射系统(ThermoFisher Scientific, GIS)喷涂有机金属铂涂层5秒。

最初，从顶部以300pa电流开始粗磨，并以小的逐步方式继续进行。同时，用扫描电镜观察细胞内伸长的细菌。当可以很清楚地看到细长的细菌时，在上部停止粗磨。底部的粗铣以300pa的电流开始，以大的逐步方式进行。当片层厚度达到1.5 μm时，将铣削电流改为100 pA，直到片层厚度达到~0.8 μm。此后，细磨主要集中在< 50 pA的底部。用电子束在5kev和13pa下监测铣削过程。最后对薄片的两侧进行精铣处理。随后用铂(15 mA, 10 Pa, 10 s)溅射涂覆栅格，以增加研磨薄片的导电性。栅格通过传送梭系统从FIB仪器中传送，并储存在液氮中(SubAngstrom, Pin型栅格盒)，以便进一步数据收集或立即由CLEM重新确认，以正确定位gbp1包被细菌。

低温et和图像处理

利用配备300 kV场发射枪、Volta相板(相移约为1/2 pi)、Quantum柱后能量滤波器(20 ev狭槽)和Gatan K2/K3峰顶直接探测相机的Titan Krios G2透射电子显微镜(Thermo Fisher Scientific)收集fib -铣削薄片样品的层析成像数据。我们首先将平台导航到薄片，并在中等放大(2250倍)下收集蒙太奇;我们使用ImageJ将TEM蒙太奇与第二个CLEM拍摄的地图重叠。薄片上的三个冰沉积物和一个双膜囊泡被用作覆盖这两张地图的共同标记。其中一个成功的GFP信号目标位于最大的冰沉积物下方，靠近片层边缘。用荧光信号将台移至目标物右侧，采集倾斜序列。使用SerialEM软件以近焦剂量分馏模式拍摄图像。得到的物理分辨率为0.45 nm/pixel。总剂量为80 e/? ²在33张倾斜图像中进行分布，倾斜步骤为3°，覆盖角度为39°至-57°，以连续数据收集方式从-9°开始第一个倾斜系列。微型电池的数据集采用剂量对称格式，不使用相位板。微细胞样品的倾斜系列以0.14 nm/像素的物理分辨率从0°开始，覆盖角度范围为51°至-51°，增量为3°，总剂量为100 e/? ²．

收集的剂量分馏数据进行运动校正，以生成漂移校正的图像堆栈文件。使用IMOD的补丁跟踪功能对堆栈文件进行对齐。采用同步迭代重建技术(SIRT)，利用Tomo3D对排列好的堆叠文件进行三维层析图重建。为了重建盒状层析图，将对齐的倾斜序列缩放到3.6 nm作为像素大小。使用IMOD进行层析成像。层析图的表面绘制使用EMAN2.23，并用UCSF嵌合体进行细化。简而言之，对于核糖体，采用模板匹配策略来确定所有核糖体的坐标和方向。一种哺乳动物80S核糖体结构(EMD-3418)由Volta相板冷冻电镜测定，而细菌核糖体结构(EMD-0076) ( 52)低通滤波至20 ?，并缩放至3.6 nm/体素以匹配层析图。利用EMAN2.3对膜、囊泡和GBP1包被特征进行分割。3型分泌系统(T3SS)针复合物的低温电镜图 鼠伤寒沙门氏菌(emd - 11781) ( 53)缩放到3.6 nm/体素，并拟合到断层图中T3SS的位置。

Subtomogram平均

使用TomoSegMemTV和PySeg包进行亚层图分析。对于初始膜分割，11张断层图来自 扫描隧道显微镜 ^?心数据集和27个断层图 扫描隧道显微镜 ^{ΔwaaG::pBAD-ftsZ}采用TomoSegMemTV ( 54)。利用PySeg包基于离散莫尔斯理论(Discrete Morse theory)对膜上的粒子进行追踪和选取。 55)。粒子垂直于膜的初始方向由PySeg测定。将拾取的粒子坐标乘以4，得到CTF校正和权值反投影重建层析图中粒子坐标信息，分节系数为2。根据外膜(OM)的特征提取亚层图，并使用Relion软件包v3 ( 56）.

在OM排列良好后，在PySeg中进行一般分类功能以区分膜和非膜特征。显示膜特征的类通过在膜的顶部应用圆柱形掩模合并为进一步的一般分类。分类结果显示，膜上的GBP1的额外密度导致获得21,587个颗粒，用于Relion包进一步约束细化和分类。在下一步的Relion分类中，使用分子掩膜进行约束细化，平均4个类别，得到12,858个颗粒，用于去除GBP1的重叠密度(图S8)。在后期处理过程中，最终的密度图是用分辨率为-1000的b因子和10 ?的低通滤波器生成的。二聚体和单体掩模的分辨率估计和傅立叶壳相关性及其控制如图S9所示。

为了对mRFP-GBP1的全涂层复合物进行距离检测，通过IMOD绘制等高线手工分割OM和GBP1密度。利用Mtk函数检测GBP1 GTPase结构域密度与LPS外叶密度之间的最短距离。11,889个GBP1原体存在于野生型LPS的?minD微细胞上;12487个GBP1原体存在于具有o抗原和外核截断LPS的?waaG微型细胞上;采用Graphpad Prism9试剂盒检测并分析了6107种GBP1原形成物在?waaG外膜囊泡(OMV)上的表达。为了检测mRFP-GBP1在微型细胞和omv上的洗膜复合物的距离，使用IMOD手动绘制3D层析图中的GBP1密度。利用EMAN2.23对清洗后的微型细胞和清洗后的OMV进行神经网络分割，并由UCSF Chimera进一步细化。

人类GBP1的计算模型

我们使用AlphaFold2来预测人类GBP蛋白家族的功能同源物。值得注意的是，GBP5蛋白(AF-A0A2K5PG15)表现出一个细长的构象，类似于人类GBP1亚断层图平均中显示的一些结构特征。最近的研究表明，缺乏C端的GBP5可以在GDP存在的情况下形成二聚体。如果 ₃ ^-(pdb id 7e5a)。

基于截断的二聚体GBP1，我们构建了一个表示二聚体GBP1激活状态的伪模型。首先，我们利用Chimera软件包中的MatchMaker功能对人类GBP1单体x射线晶体结构(6K1Z)的n端结构域和MD区域进行了比对;与GBP5二聚体(PDB ID 7E5A)的一个单体亚基相比，它显示了沿GTPase结构域轴的147°旋转和-14.7 ?位移。然后，我们使用Chimera将GBP1的c端区域与预测的GBP5单体(AF-A0A2K5PG15)对齐。最后，通过AlphaFold2构建开放GBP1构象的伪模型，并使用Chimera将其对接到我们的低分辨率平均GBP1结构亚层析图中。它得到了细长的GBP1单体和二聚体模型，与我们的单体和二聚体掩膜获得的天然结构相对应。

减少GBP1拥挤的顺序洗涤方法

重组包被复合物后，我们通过14000离心收集未标记的GBP1包被微型细胞 g室温下静置5分钟(Eppendorf离心机5420,SN, 5420JQ303731)。将微球在包衣缓冲液[50 mM HEPES (pH7.5)， 150 mM NaCl, 1 mM MgCl]中洗涤 ₂轻轻地移液10次。然后通过离心再次收集gbp1包被的微型细胞，并进行相同的洗涤处理。再重复一次，总共30次移液管辅助洗涤和去除释放的GBP1。然后将包被的微型细胞溶解在包被缓冲液中，准备用于冷冻et样品制备。该方法被证明是高效的，根据分段层析成像系列的直接计数，将拥挤度从每微小细胞约12,000 GBP1分子降低到每微小细胞约100至120分子(>100倍损耗)。

Ni-NTA-nanogold标签

含有六个组氨酸残基的His标签(His ₆)与GSG连接器融合到GBP1的N端。净化他的 ₆-GBP1在涂膜缓冲液中用1 mM GTP稀释至2 μM，与细菌微细胞悬浮液混合，如重组实验所述。在全涂层形成后，细胞悬浮液在6200下离心 g将含有细菌微型细胞和GBP1包被的微球溶解在阻断结合缓冲液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 5% BSA, 1mM MgCl2)中，室温孵育10分钟。在阻断结合缓冲液中加入稀释1:10的1.8 nm Ni-NTA-Nanogold beads (Nanoprobes)，孵育10 min。6200离心 g用50 mM Tris-HCl、100 mM咪唑、1 mM MgCl2、0.1% Tween 20和300 mM NaCl (pH 7.4)洗涤3次。最后将微细胞颗粒溶解在涂层缓冲液中，并转移到发光碳涂层铜网格上，用于低温et样品制备。

二硫交联试验

为了测试GBP1的开放构象模型，我们采用了半胱氨酸替代策略进行交联。选择6个存在于GBP1 α7螺旋中间结构域且面向GED结构域α12螺旋的残基(glu389、Ile-369、glu366、Ile-365、Arg-362和glu361)作为潜在的Cys-Cys对。我们测量了上述选择的残基与相邻残基(Lys-520、Ser-523、Glu-526、His-527、Gln-530和Glu-533)在GED结构域α12上的Cβ原子之间的距离，并选择了距离最近的残基作为交联候选者(间距在2 ~ 7埃之间)。将这些残基突变为半胱氨酸后，我们直接观察到它们靶向细胞质 Stm在celllo(无花果。S13A, B)。这证实了没有明显的结构改变会干扰目标。我们选择中间的R362C-E526C突变体中Cys-Cys键间长度最短的突变体(2 ?)制作重组RFP-GBP1，用于直接无细胞包衣实验。在DTT(一种还原剂)存在或不存在的情况下，通过体外重构试验对其进行了检测。具体来说，是ys配对的GBP1 ^R362C-E526C经mRFP标记纯化后与细菌(OD = 0.1)混合，用150 mM NaCl, 1 mM MgCl包被缓冲液(HEPES缓冲液) ₂pH 7.4)。通过在涂层缓冲液中加入终浓度为1mm的DTT，在还原条件下进行重构分析。

硅蛋白序列分析

对于与其他相关gtpase相比，人类GBP1中的脂质结合基序，使用最大似然方法和基于JTT矩阵的模型推断进化树历史。从10,000个重复中推断出一个bootstrap共识树来代表所分析的分类群的进化史。在< 50%的引导复制中复制的分区对应的分支被崩溃。通过对JTT模型估计的两两距离矩阵应用Neighbor-Join和BioNJ算法自动获得启发式搜索的初始树，然后选择对数似然值较优的拓扑结构。采用离散Gamma分布对5类(+G，参数= 2.8088)位点间的进化速率差异进行建模。在MEGA X中进行了进化分析。

统计数据

数据分析采用GraphPad Prism 9.1.1软件。Excel v16.54软件。除非另有说明，统计学显著性是由 tBonferroni检验(双尾)或单因素方差分析(Dunnett多重比较检验) 因果测试。