Nature子刊：膜蛋白胞外相互作用综合分析的创新技术

本研究介绍了一种利用邻近生物素化酶AirID与抗原结合片段(FabID)融合的前沿方法，以探索表皮生长因子受体(EGFR)的细胞外蛋白-蛋白相互作用(exPPIs)。通过实现细胞膜上EGFR附近蛋白的精确生物素化，以及随后的LC-MS/MS分析，该方法揭示了已知和新的EGFR相互作用物。它强调了这些相互作用如何随着EGF配体和吉非替尼治疗而动态变化，为受体生物学和药物开发提供了新的见解。

　　

1. 背景

体内许多蛋白质与其他蛋白质形成复合物，决定细胞的命运。因此，蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的分析是了解靶蛋白生物学功能的关键过程。膜蛋白占人类基因的30%以上，在细胞功能中起着至关重要的作用。已知许多膜蛋白形成复合物以发挥其功能，因此阐明膜蛋白PPIs对于理解蛋白质功能至关重要。然而，分析PPIs的技术，特别是活细胞的细胞外蛋白-蛋白相互作用(exPPIs)的技术发展一直滞后。最近，近距离标记方法，标记蛋白质在近距离的大规模PPI分析已引起关注。然而，针对膜蛋白胞外区域的接近蛋白标记方法主要涉及使用具有细胞毒性的分子进行PPI分析，这促使人们寻找针对活细胞的系统。 

2. 研究发现

爱媛大学的蛋白质科学中心独立开发了邻近依赖的生物素标记酶AirID (Kido等人，eLife 2020)，该酶可对靠近的蛋白质的赖氨酸残基进行生物素化。已有几项研究使用邻近依赖性生物素标记酶进行exPPI分析，但它们涉及的基因修饰蛋白的形状与其原始结构有很大不同，因此不清楚分析结果在多大程度上反映了原始相互作用。为了准确地了解活细胞细胞膜上发生的相互作用，有必要开发一种技术，可以直接针对细胞表达的蛋白质进行exPPI分析。因此，我们的研究小组在有可能通过创建一个分子(FabID)来分析exPPI的前提下启动了这项研究，该分子将AirID融合到识别膜蛋白胞外结构域的抗体的抗原识别位点。

exPPI分析的膜蛋白是表皮生长因子受体EGFR，一种被称为位于细胞膜上的癌症基因的蛋白质。将FabID和生物素添加到表达EGFR的上皮样癌源细胞(A431细胞)(以下简称上皮癌细胞)中，在细胞培养水平证实FabID可使细胞膜上的EGFR生物素化。

通过结合生物素标记与FabID和德岛大学开发的用于分析生物素化蛋白的质谱，我们成功地鉴定了许多新的EGFR相互作用蛋白。鉴定出的蛋白质有可能成为新的药物靶点。

EGFR通过与称为EGF的配体结合将信号传递给细胞。众所周知，当EGF与EGFR结合时，各种蛋白与EGFR的胞内结构域结合，形成蛋白复合物。目前，广泛用于癌症治疗的EGFR酪氨酸激酶抑制剂被认为是通过与EGFR结合并抑制细胞内EGFR介导的蛋白复合物的形成来发挥其治疗作用的。然而，当EGFR与EGF(配体)结合或EGFR酪氨酸激酶抑制剂(药物)起作用时，EGFR的配体依赖性和药物依赖性expppi变化完全没有被观察到。因此，我们使用FabID观察了EGFR在培养细胞中发生的配体依赖性和药物依赖性expppi变化。因此，我们是世界上第一个发现当配体和药物与EGFR结合时，expppi会发生动态变化。 

3. 涟漪效应

几乎所有的生物体都利用膜蛋白在细胞内外传递信息。因此，分析膜蛋白的exPPI有望直接促进受体生物学的发展。此外，由于大多数商业药物通过靶向膜蛋白发挥作用，膜蛋白被称为重要的药物靶点。然而，寻找新的膜蛋白药物靶点是具有挑战性的，并且一直是制药行业的一个重要问题。本研究开发的FabID技术不仅可以使用活细胞进行exPPI分析，还可以用于识别新的药物靶点。此外，还发现FabID可以捕获传统方法无法分析的配体依赖性和药物依赖性expppi变化。在未来，通过FabID分析exPPI来识别新的药物靶点，并详细分析商业药物结合时膜蛋白exPPI的变化，有望为商业药物的开发做出重大贡献。