减少脂肪生成的新靶标

　　

食物消耗后营养物质的储存需要一个适当的平衡，肝脏帮助引导进入体内的葡萄糖生成糖原和/或脂肪。过量的脂肪产生会导致脂肪肝疾病和炎症的发展，所以这个过程需要仔细调节。新研究发现糖生成过程中产生的代谢物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)被运送到高尔基体，在那里它阻断一种叫做S1P的蛋白酶，从而抑制脂肪生成。在人类类器官和非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，用UDPG治疗可促进糖生成并减少脂质积累，这表明其具有治疗应用的潜力。

现在，发达社会的人们摄取了大量的食物，并让他们的肝细胞承担以糖原或脂质形式储存多余葡萄糖的生理任务。尽管这两种形式的能量储存很重要，但肝细胞选择糖生成或脂肪生成进行葡萄糖碳储存的方式尚不清楚。在这项研究中，我们提供的证据表明，葡萄糖作为糖原的储存优先于脂质储存。我们发现尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，一种糖生成的代谢中间体，可以被运输到肝细胞的高尔基体，在那里它与1号位点蛋白酶(S1P)结合，抑制S1P介导的甾醇调节元件结合蛋白(SREBPs)的裂解，从而抑制脂肪生成和促进糖生成。

基本原理

肝细胞可以选择糖生成或脂肪生成来储存葡萄糖能量，然而，它们会导致不同的后果。糖原降解促进活性氧(ROS)的清除，但脂肪酸氧化导致ROS的产生。鉴于ROS水平升高有助于脂肪变性并进一步诱导非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，肝细胞可能优先利用糖生成来储存葡萄糖并在需要时提供能量。

结论

使用小鼠和人原代肝细胞，我们发现葡萄糖碳在脂肪生成之前迅速流向糖生成。糖原酶的敲低使脂肪生成优先，强调了拮抗关系。此外，我们发现糖生成的关键代谢物UDPG可以下调脂肪生成基因，从而抑制脂肪生成。高尔基体中的SREBPs被S1P裂解生成活性形式，从而进入细胞核促进脂质基因表达。通过共免疫沉淀、click化学、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和药物亲和反应靶稳定性(DARTS)分析，我们证明了UDPG在体内和体外直接与S1P结合。这个绑定没有改变        S1PmRNA表达，但下调其蛋白在肝细胞中的表达。通过分子对接、点突变实验和圆二色光谱，我们进一步证明了Asn⁴³⁸ UDPG的结合需要S1P位点;结合后，S1P的构象发生改变，导致S1P通过泛素-蛋白酶体途径降解，从而损害SREBP的裂解和随后的脂肪生成抑制。溶质载体家族35成员F5 (SLC35F5)被确定为介导UDPG进入高尔基体的转运蛋白。给药UDPG后，小鼠的脂肪生成基因下调，从而减少脂肪酸合成，减轻肝脏脂肪变性。在NAFLD患者的原代人肝细胞和组织中也观察到一致的结果，强调了这些发现的翻译相关性。

结论

在摄取食物后，基本能量分子葡萄糖通过门静脉转运到肝脏，让肝细胞承担处理多余葡萄糖的生理任务，通过糖生成或脂肪生成来储存能量。尽管胰岛素指示肝细胞激活糖生成和脂肪生成以储存葡萄糖分子，但我们的数据显示，肝脏中的糖生成——通过中间代谢物UDPG，它被分流到高尔基体以使S1P酶活性失活——导致SREBP切割被抑制，从而抑制脂肪酸的重新合成。这种代谢调节可能也发生在其他产生糖原的细胞中，对这种代谢调节的发现提供了对肝细胞如何精确处理糖和脂质储存的见解。在治疗上，这种UDPG介导的脂肪生成调节可能为人类异常脂质代谢的管理开辟了途径。

肝细胞的糖生成抑制脂肪生成

为了探索葡萄糖碳流对糖生成或脂肪生成的优先性，我们向无葡萄糖培养基处理的原代肝细胞补充葡萄糖。我们发现肝细胞迅速利用葡萄糖合成糖原，糖原水平在补充后15分钟开始升高，比色法证实了这一点。相比之下，脂肪生成在1小时后开始。这种糖生成的优先权也被¹³C跟踪。排除血清胆固醇对脂肪生成的可能影响。我们另外用无血清和无葡萄糖培养基预处理细胞2小时，导致糖原水平最低，并且获得了类似的结果，表明肝细胞优先以糖原形式储存葡萄糖。肝磷酸葡萄糖糖化酶1 (PGM1)是第一个催化糖生成的酶。击倒的       Pgm1导致葡萄糖碳流从糖生成到脂肪生成的快速转换。与此一致的是，编码UDPG焦磷酸化酶2 (Ugp2)，第二种糖原酶，催化G1P到UDPG，也导致转向脂肪生成。转染RNA干扰(RNAi)抗性       Pgm1或       Ugp2载体进入敲除细胞，恢复糖生成，抑制碳流向脂肪生成。总之，这些结果表明糖生成可能在糖碳同化过程中对抗肝细胞的脂肪生成。

 

UDPG抑制脂肪生成

接下来，我们研究了肝细胞中糖生成抑制脂肪生成的方式。我们推测糖生成的中间代谢物对脂肪生成具有抑制作用。UDPG是糖生成过程中的关键代谢物，由PGM1和UGP2共同调节。我们找到了敲掉Pgm1或Ugp2导致肝细胞UDPG降低。然而，UDPG的加入抑制了葡萄糖碳流向脂肪生成，如甘油三酯和减少¹³C示踪棕榈酸和油酸。与此一致的是，脂肪生成基因，包括       Acaca，       Fasn,       Scd1在UDPG处理的肝细胞，提示UDPG抑制脂肪生成。考虑到PGM1在糖生成过程中催化G6P生成G1P，而UGP2催化G1P生成UDPG，这一发现提出了G1P调节脂肪生成的可能性。然而，外源性G1P的进口进入Ugp2-敲低肝细胞不影响脂肪生成。此外，糖原磷酸化酶抑制剂(GPI)阻断糖原降解可增加糖原和UDPG水平。这也导致肝细胞脂肪生成的减少。相比之下，糖原磷酸化酶肝形式(PYGL)的过表达下调了糖原和UDPG水平，从而促进脂肪生成。此外，我们排除了糖原本身对脂肪生成的调节Gys2导致糖原和甘油三酯，但肝细胞UDPG升高。与此相一致，13C葡萄糖示踪显示，预先进行无糖和无血清处理的原代肝细胞中，M+6 UDPG与脂肪生成呈反比变化。UDPG通常通过UDP-葡萄糖6-脱氢酶(UGDH)转化为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA) 。我们发现添加UDPGA对肝细胞的脂肪生成没有影响。尽管在胰岛素存在的情况下，脂肪生成落后于糖生成，但我们发现，即使在胰岛素存在的情况下，UDPG仍保持其对脂肪生成的抑制作用。考虑到AKT和S6K的磷酸化未发生改变，这一结果并非由于UDPG治疗使胰岛素信号失活。总之，这些结果表明，糖生成动员中间代谢物UDPG对抗肝脏脂肪生成。

UDPG破坏高尔基体中SREBP的裂解

接下来，我们研究了UDPG抑制脂肪生成的分子基础。SREBP1a、SREBP1c和SREBP2是参与脂质合成的关键转录因子。SREBP-1的表达受胰岛素调控，而SREBP-2的表达更依赖于甾醇。SREBP1c作为肝脏中SREBP1的主要形式，对肝脏脂肪生成至关重要;它最初以全长形式存在于内质网(ER)膜中，与SREBP裂解激活蛋白(SCAP)相互作用。在没有胆固醇的情况下，SCAP护送SREBP进入COPII囊泡，然后进入高尔基体，S1P和位点2蛋白酶(S2P)将SREBP切割成N -SREBP (SREBP的N端)，从而转激活脂质基因。在UDPG处理的肝细胞中，SREBP1a、SREBP1c和SREBP2 mRNA不受影响，而裂解形式的SREBP1则受到抑制。结果表明，UDPG负调控高尔基体中SREBP的切割，从而抑制肝脏脂肪生成。

UDPG通过结合S1P阻断SREBP的裂解

接下来，我们试图阐明UDPG如何调节SREBP切割。使用荧光标记的UDPG治疗胆固醇缺失的肝细胞，我们发现UDPG不局限于内质网，而是存在于高尔基体，以液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 。使用空腹肝细胞，我们发现葡萄糖的供应允许高尔基与细胞质UDPG比值的初始增加，1小时后达到峰值，随后下降，与肝细胞脂肪生成增加相关。然而，敲除Pgm1或Ugp2，或过度表达       Pygl，降低了高尔基体。S1P和S2P分别在高尔基结构域和跨膜结构域的管腔环上切割SREBP，生成n-SREBP。我们推测UDPG结合了S1P和/或S2P，从而干扰了SREBP的切割。使用血凝素(HA)标记的SREBP1c, S1P或S2P与UDPG孵育，我们发现UDPG结合S1P而不是SREBP1c或S2P, LC-MS/MS 。此外，我们使用点击化学方法拉下与UDP-2-N3-Glc (Azido-UDPG)连接的蛋白质用于MS。结果表明，UDPG只结合S1P而不结合S2P或SREBP。基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示，udpg结合蛋白在脂肪酸代谢途径中富集。同时，利用强迫过表达S1P和SREBP1c的人胚胎肾(HEK) 293T细胞，我们发现添加UDPG。然而，这种UDPG介导的效应并未发生在S1P敲低的肝细胞中。通过生物层干涉(BLI)测定，我们发现UDPG直接与S1P结合。

SLC35F5将UDPG转运到高尔基体

鉴于糖原发生在产生UDPG的细胞质中，我们进一步研究了UDPG是如何从细胞质转运到高尔基体的。溶质载体家族35 (SLC35)是一种III型跨膜蛋白，包含从SLC35A到SLC35G的7个亚家族，被认为介导细胞质核苷酸糖向高尔基囊腔的运输(       37–       39)． 通过检测mRNA表达，我们在小鼠肝细胞中发现了大量SLC35成员。前10名候选人(       a1，       a3，       a4，       b1，       d1，       d2，       e1，       e2，       f5,       f6)被sirna敲除。脂质结合染料BODIPY的流式细胞分析显示，敲除后荧光强度最高       Slc35f5。结果，这样       Slc35f5LC-MS/MS和荧光显微镜均证实，敲除抑制了UDPG进入高尔基体，同时肝细胞中n-SREBP1、脂肪生成基因表达和脂肪酸合成的上调。为了在体内验证体外结果，我们敲除       Slc35f5在小鼠肝细胞中使用基于流体动力学的基因传递(       40)． 我们发现葡萄糖向糖原的流动减少了但向甘油三酯的流动在肝组织中增加了       Slc35f5-敲除小鼠Slc35f5促进UDPG进入高尔基体，随后下调细胞内n-SREBP1、脂肪生成基因表达和脂肪酸合成。此外，UDPG处理对脂肪生成的抑制作用更强       Slc35f5超表达。总之，这些结果表明肝细胞动员SLC35F5将UDPG转运到高尔基体。

在小鼠模型中，UDPG治疗可减轻肝脏脂肪变性

UDPG抑制肝脏脂肪生成为控制和减轻肝脏脂肪变性提供了机会。禁食12小时后，小鼠腹腔注射葡萄糖[2 g/kg体重(g/kg)]。通过比色法解剖肝脏，我们发现糖原水平在补充后15分钟开始升高，6分钟后在肝细胞中检测到脂肪生成。值得注意的是，腹腔注射UDPG可进一步延迟脂肪生成时间点。通过腹腔注射UDPG类似物UDP-2-N3-Glc，证实了这种外源性UDPG进入肝细胞。与糖生成和脂肪生成的起起落落一致，       C¹³体内标记葡萄糖示踪显示，肝脏M+6 UDPG水平在开始时升高，但随后下降。然后用UDPG (8 mg/kg，每天1次)给小鼠正常饮食治疗7 d 。结果显示，虽然总甘油三酯含量仅下降13%，但与未处理的小鼠相比，新合成脂肪酸的数量明显减少，这促使我们推测UDPG可能是治疗NAFLD的潜在药物。为此，我们给小鼠喂食高脂肪饮食(HFD) 16周，使其发展为NAFLD，表现为肝脏球囊变性、脂滴积聚、肝脏和血清中甘油三酯和胆固醇的积累。值得注意的是，周期性酸-希夫(PAS)染色和LC-MS/MS分析显示肝脏中糖原含量和UDPG水平降低，伴随着…的下调       Pgm1和       Ugp2表达式，提示NAFLD小鼠的肝糖生成受到限制。从第8周开始，HFD小鼠持续喂食HFD，但接受UDPG治疗，持续8周。我们发现UDPG治疗对食物摄入没有明显影响，但可以减轻体重。然而，苏木精和伊红(H&E)染色显示，UDPG处理可防止球囊变性和脂滴积聚，UDPG处理可降低肝脏和血清中的甘油三酯和胆固醇，伴随着…的下调       Acaca，       Fasn,       Scd1还原后的n-SREBP1。与这些结果一致，UDPG处理恢复了糖原生成，证明了糖原含量和       Pgm1和       Ugp2表达式。同时，这种UDPG治疗既不影响血糖水平、葡萄糖耐量和酮体水平(β-羟基丁酸)，也不改变肝脏糖异生酶和胰岛素信号。此外，给药的UDPG可以转移到高尔基体，在那里与S1P结合。此外，我们发现在UDPG处理后，SLC35F5在高尔基体中上调。 总之，这些结果表明，UDPG可能是治疗肝脂肪变性的潜在药物。

NAFLD患者的糖生成通过UDPG拮抗脂肪生成

最后，我们试图在人类肝细胞和NAFLD患者样本中验证我们的发现。首先，我们利用人S1P、S2P和SREBP1c，证实了UDPG与人S1P结合，而不是与人S2P或SREBP1c结合，这一点通过LC-MS/MS分析和BLI检测得到了证实。 相应的，关键残基(N438A或T593A)的突变破坏了人类S1P与UDPG的结合。通过将人S1P和SREBP1c载体共转染HEK293T细胞，我们也证实了UDPG破坏了S1P对人SREBP1c的切割。然后，我们从肝血管瘤患者的肝组织中分离原代肝细胞。我们证明糖原含量增加，但在体外治疗UDPG后，甘油三酯和人n-SREBP1水平下降。此外，使用无血清和无葡萄糖培养基，我们还证明，原代人肝细胞在30分钟内开始增加糖原，但甘油三酯在葡萄糖补充后2小时增加。 这种糖生成的优先权也被       ¹³C跟踪。 通过收集正常和NAFLD肝组织，我们发现NAFLD组织中糖原和UDPG水平降低(       n = 5)，与正常组织相比，PGM1和UGP2同时下调。ACACA，       FASN,       SCD1NAFLD肝细胞中的表达上调，同时n-SREBP1表达增加。为了进一步验证这些结果，我们使用游离脂肪酸(油酸与棕榈酸比例为2:1)诱导离体原代肝细胞脂肪变性(       41，       42)，然后进行UDPG治疗。我们发现，UDPG处理导致糖原含量增加，甘油三酯和n-SREBP1降低，并下调       ACACA，       FASN,       SCD1。此外，UDPG治疗增加       SLC35F5细胞中mRNA的表达。最后，我们用油酸诱导人肝细胞类器官脂肪变性。我们发现，确实，UDPG治疗增加了类器官中的糖原含量，降低了甘油三酯含量。总之，这些结果表明UDPG抑制人肝细胞和NAFLD患者的脂肪生成。

讨论

在这项工作中，我们报告了肝细胞中糖生成对脂肪生成的调节。饭后，过量葡萄糖的流动可被引导到肝脏的糖生成或脂肪生成。然而，糖生成的中间代谢物UDPG可能通过转运体SLC35F5分流到高尔基体，在那里UDPG与S1P结合并促进其泛素化降解，从而破坏S1P介导的SREBP裂解和随后的脂肪生成。

长期以来，糖原一直被认为仅在肝脏和肌肉中储存和供应能量(1,3)。我们之前的研究表明，糖原的合成和降解通过激活戊糖磷酸途径来调节细胞氧化还原稳态(10 - 12,15)。然而，糖原代谢异常可能导致肿瘤发生(45,46)。此外，我们证明了促炎M1巨噬细胞使用糖原合成来激活P2Y14信号通路，促进STAT1的表达和磷酸化(10)。因此，糖原的生理功能并不局限于能量储存，其病理生理作用值得全面研究。在本研究中，我们通过提供糖原代谢物UDPG调节脂肪生成的证据进一步强调了这一概念。我们发现，随着糖生成和脂肪生成的起落，UDPG水平在开始时升高，但随后下降。这种udpg介导的调节似乎是非常特异性的，因为udp -葡萄糖酸盐不抑制脂肪生成。此外，虽然胰岛素信号刺激糖生成和脂肪生成，但我们发现UDPG的作用超出了胰岛素信号。然而，为了实现调节，UDPG需要进入高尔基体，在那里它被运送到高尔基腔。核苷酸糖转运蛋白的溶质载体家族被命名为SLC35，它促进胞质核苷酸糖的运输，使其穿过细胞膜进入内质网或高尔基体管腔(47,48)。在这项工作中，我们证明了SLC35F5介导UDPG进入高尔基体腔，UDPG在这里与S1P结合。

S1P是一种膜结合丝氨酸蛋白酶。通过序列分析，我们发现S1P在人类和其他物种中高度保守。我们还观察到，据称UDPG在S1P序列上的结合位点是高度保守的，这表明UDPG对脂肪生成的抑制作用可能适用于不同物种。S1P作为一个关键角色，通过切割SREBP并启动具有转录活性基因的n端片段的释放，控制肝细胞和其他细胞的脂肪生成，这些基因编码参与胆固醇和脂肪酸生物合成的酶，以及低密度脂蛋白受体。通过LC-MS/MS和BLI，我们证实UDPG与S1P结合，从而抑制S1P介导的SREBP裂解。

鉴于新生脂肪生成的增加是NAFLD的主要原因，UDPG可能是NAFLD治疗的有希望的候选者，具有以下几个优势:(i)由于其存在于外周血的细胞外，UDPG可能适合静脉给药(49);(ii)考虑到UDPG在血液中的生理存在，给药可能对患者有利(10,50);(iii)肝细胞对UDPG的摄取，如本研究所证实，证明了其在调节肝脏脂肪生成方面的可行性;UDPG可能促进糖原代谢，通过调节戊糖磷酸途径促进ROS清除(10-12)。我们的发现与脂肪生成增加是NAFLD的一个明显特征的概念是一致的(51)。确定的udpg介导的脂肪生成调节可能为人类异常脂质代谢的管理开辟治疗途径。