揭示伪装的干细胞

　　

我们的免疫系统不仅对肿瘤疾病的发展提供持续的监测，而且还可以人为地重新编程以识别和根除已建立的恶性肿瘤，这一发现改变了我们对肿瘤治疗和预后的看法。单克隆抗体(mAbs)的开发为抗原靶向癌细胞铺平了道路，并导致了嵌合抗原受体(CAR) T细胞的发展。这种革命性的细胞疗法在复发或难治性急性B淋巴母细胞白血病中显示出前所未有的疗效，完全缓解率高达90%。这些结果可能是由于CD19靶抗原的高水平、均匀表达和B细胞发育不全的耐受性，其持续耗损与患者的长期生存相一致。

尽管有广泛的热情，但将CAR-T细胞应用于其他癌症的尝试遇到了不可避免的障碍，例如，缺乏健康组织所不具有的安全可操作的肿瘤相关抗原。其中一个例子是急性髓系白血病(AML)，其靶抗原[例如CD33、CD123、fms样酪氨酸激酶3 (FLT3)、c型凝集素样分子-1]是由造血干细胞和祖细胞(HSPCs)或分化的髓系细胞表达的(2,3)。与b型白血病和淋巴瘤相反，CAR介导的髓系和HSPCs的长期缺失不可避免地导致先天免疫的严重缺陷，感染风险增加，潜在的长期造血发育不全。在同种异体造血干细胞移植(HSCT)或CAR-T细胞可调耗竭之前，将免疫疗法作为桥接治疗都是可行的治疗选择。尽管如此，将免疫治疗效果限制在相对较短的时间窗口可能严重影响根除残余肿瘤细胞的能力。通过CRISPR-Cas敲除(KO)来消除供体造血干细胞中的靶抗原，以避免靶上杀伤。然而，这种方法只适用于造血发育所必需的基因，从而增加了肿瘤通过抗原丢失或下调而免疫逃逸的风险。此外，核酸酶介导的KO不能安全地适应多路复用，这限制了同时靶向多个抗原的机会。

我和我的同事们假设，在用于骨髓移植的健康HSPCs中精确设计目标表位可能会破坏CAR-T细胞的结合，而不影响修饰蛋白的功能，从而完全保留干细胞的再生和分化能力。关键的是，这种策略使我们能够靶向对白血病生存至关重要的基因，而不管它们在健康造血中的表达或作用如何，从而产生强大的抗白血病功效，同时具有最小的靶内或肿瘤外毒性。我们的研究小组证明了通过表位碱基编辑，赋予HSPCs对靶向AML细胞上广泛表达的三种细胞因子受体的CAR-T细胞的选择性抗性的可能性。 FLT3和KIT是酪氨酸激酶受体，分别在93%和85%的AML病例中表达。CD123是白细胞介素-3受体的一个亚基，白细胞介素-3受体是一种I型细胞因子受体，在>75%的AML病例中发现。这些基因在造血发育的各个阶段表达，它们在AML中的过度表达与较低的生存率和复发风险增加有关。

通过表位定位文库实验，我们发现单氨基酸替换足以破坏治疗性单克隆抗体识别，尽管保留了表面表达。因此，cd28共刺激CAR-T细胞的体外杀伤实验表明，表达表位编辑变体的细胞对car介导的杀伤具有抗性，不会引发T细胞活化或脱颗粒，而野生型FLT3、KIT或CD123则被消除。由于表位工程可以通过点突变实现，因此我们推断，与同源定向修复相比，碱基编辑(be)可能是一种合适且更安全的选择，它不需要双链DNA断裂或模板供体。       通过电穿孔带有腺嘌呤碱基编辑(sgRNA+ABE)变体的单导RNA，我们在人类CD34+ HSPCs中实现了高效的表位编辑(~85%)，毒性小，脱靶性好。与先前对核酸酶介导的编辑的观察相反，BE效率在批量和更原始的HSC富集亚群中相似。关键的是，FLT3、CD123和KIT的表位修饰可以用相同的ABE进行，原则上允许多路复用。

接下来，我们评估了编辑后受体功能的保存(例如，配体亲和力、信号转导的激活、增殖、转录和磷酸化蛋白质组反应)，并发现了与野生型受体相当的特征，无论是在基线还是在配体刺激下。经过编辑的造血干细胞对CAR-或单克隆抗体介导的体外杀伤具有耐药性，并证实这些“伪装”的干细胞即使直接暴露于免疫疗法也能存活。在NBSGW小鼠中进行的严重联合免疫缺陷(SCID)再繁殖实验显示，原发性和继发性受体均保持了再繁殖和多谱系分化能力。

为了评估CAR-T细胞是否能够在保留表位编辑造血功能(AML免疫治疗的“圣杯”之一)的同时选择性地消除AML细胞，我们将HSPCs和人类患者来源的AML异种移植物(PDXs)顺序植入NBSGW小鼠。用FLT3-CAR治疗的小鼠实现了AML的完全根除。与此同时，我们观察到CD19+的大量消耗仅在腺相关病毒整合位点1(AAVS1)对照组中存在造血亚群(前b、前b)、粒细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞和淋巴细胞引发的多能祖细胞，而移植FLT3-BE HPSC的小鼠则受到保护。与AAVS1-BE相比，暴露于FLT3-BE造血的CAR-T细胞显示出较低的程序性细胞死亡蛋白1表达，表明激活和衰竭减少。通过我们方法的概念验证数据，我们测试了表位编辑是否允许多路复用。当暴露于FLT3+CD123 CAR-T细胞时，联合双FLT3+CD123 BE能够在体内保护造血谱系，这反过来可以根除对FLT3靶向单独的PDXs耐药，强调了多靶点免疫疗法的潜力。

我们的研究提供了证据，证明正常组织共享的肿瘤相关抗原可以通过精确修饰健康细胞中的靶表位来安全靶向，从而赋予它们选择性抗性并产生人工白血病限制抗原。在我们的工作中开发的创新工具可以提高癌症免疫治疗的治疗指数，并使长期抗肿瘤维持。此外，通过限制对白血病细胞的靶向活性，表位编辑可以减少CAR-T细胞暴露的抗原负担，减少不希望的CAR-T细胞刺激和衰竭。最后，表位编辑可以很容易地实现多路复用，以实现联合治疗，同时避免重叠的毒性。尽管关于复杂基因组工程细胞疗法的临床可行性的几个问题仍未得到解答，但我们认为，当靶向或非肿瘤毒性是成功翻译的关键限制因素时，表位工程是开发更安全、更有效的免疫疗法的关键成就。