CRISPR在活体动物基因编辑方面取得了巨大的飞跃

　　

抗体靶向的“包膜运载工具”选择性地编辑T细胞来制造CAR -T细胞。

如今，大多数被批准的基因疗法，包括那些涉及CRISPR-Cas9的疗法，都是对从体内移除的细胞发挥作用，然后将编辑过的细胞送回患者体内。

这项技术是针对血细胞的理想方法，也是目前新批准的用于镰状细胞性贫血等血液疾病的CRISPR基因疗法的方法。在这种疗法中，在患者的骨髓被化疗破坏后，编辑过的血细胞被重新注入患者体内。

CRISPR-Cas9传递研究进展

1月11日发表在《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上的一种新的、精确靶向的CRISPR-Cas9递送方法，可以在体内对非常特定的细胞亚群进行基因编辑——这是向可编程递送方法迈出的一步，这种方法将在给患者提供编辑过的血细胞之前，消除对患者骨髓和免疫系统的破坏。

这种递送方法是在加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室开发的，Doudna是CRISPR-Cas9基因组编辑技术的共同发明人之一。该方法包括将Cas9编辑蛋白和引导RNAs包裹在一个膜泡中，膜泡上装饰着单克隆抗体片段，这些单克隆抗体会锁定特定类型的血细胞。

探索病毒包膜

作为演示，创新基因组研究所(IGI) Doudna实验室的CRISPR研究员Jennifer Hamilton针对免疫系统中的一种细胞——T细胞——这是一种革命性的癌症治疗方法嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的起点。Hamilton和她的同事们对配备了人源化免疫系统的活老鼠进行了治疗，并将它们的人类T细胞转化为CAR -T细胞，这些细胞能够锁定并消灭另一类免疫细胞——B细胞。

这一壮举是对原理的证明，显示了使用这种载体方法(包膜运载工具)靶向和编辑活体动物(体内)的血细胞和其他类型细胞的潜力，并最终应用于人类。

“我们的方法包括多路靶向分子，也就是说，在我们的粒子上有两个或更多的靶向分子，它们与目标细胞相互作用，有点像计算机中的AND门，”Hamilton说，他指的是只有在两个事件同时发生时才工作的逻辑电路。“当颗粒使用两种抗体配体相互作用结合时，我们能够获得更有效的递送。在用T细胞靶向载体治疗小鼠后，我们在我们感兴趣的细胞类型T细胞中观察到基因组工程，而不是在肝脏肝细胞中。”

她说，对于所有将基因送入细胞的方法来说，高度特异性的靶向都是困难的。尤其是肝细胞，往往会接受其他地方的递送载体。

Hamilton和她的团队正在研究几种提供基因治疗的实验技术之一。许多人使用包裹病毒的外壳——将病毒掏空，然后填充纠正性转基因或基因编辑工具，如CRISPR-Cas9。其他方法，包括IGI研究人员正在探索的一种方法，依赖于直接向小鼠注射细胞穿透Cas9蛋白来实现基因组编辑。

Hamilton博士研究的是流感等包膜病毒，她专注于这类病毒的工程设计，因为它们有一层更灵活的外壳，由它们发芽的细胞的外膜组成。

在2021年的一篇论文中，她证明了HIV-1病毒的外包膜已经被掏空并充满了Cas9，她称之为病毒样颗粒(VLP)，可以编辑培养(体外)的T细胞并将其转化为CAR -T细胞。从那时起，她对病毒包膜进行了很大的改变，现在她把它们称为包膜运载工具(EDVs)。

EDVs的一个关键方面是它们的外包膜可以很容易地被一个以上的抗体片段或靶向配体修饰，这大大提高了靶向特异性。其他基因传递载体，如腺相关病毒和脂质纳米颗粒，已被证明难以精确定位。

Hamilton说:“人们正在努力重新定位所有这些载体，使它们对一种细胞类型具有特异性，并使它们对其他细胞类型的递送失去针对性。你可以展示抗体或抗体片段，就像我们一直在做的那样，但旁观者细胞的摄取仍然相当高。你可以偏置一种细胞类型，但你仍然可以观察到旁观者细胞的摄取。在我们的论文中，我们实际上观察了肝脏，看看我们是否脱靶了，但没有发现。我认为用更传统的无包膜病毒载体或脂质纳米颗粒来实现这一目标更具挑战性。”

体内CRISPR CAR -T细胞治疗

在这篇论文中，汉密尔顿和她的同事们试图在体内复制一种体外CRISPR CAR -T细胞疗法，该疗法成功地用于癌症患者，该疗法于2020年在《科学》杂志上发表。这种疗法不仅提供了针对癌细胞的受体的转基因，而且使用CRISPR敲除了不针对癌症的受体。

加州大学伯克利分校的研究人员成功地敲除了天然的T细胞受体，并传递了一种针对B细胞的受体的转基因，B细胞是癌细胞的代表。由于Cas9蛋白与转基因一起在同一EDV内传递，因此它的寿命比传递Cas9基因的方法短，这意味着更少的脱靶编辑。

Hamilton说:“在这篇论文中，我们试图实现的是跳过必须在体外设计细胞的整个步骤。我们的目标是系统地管理一个单一的载体，可以在体内特定的细胞类型中进行基因传递和基因敲除。我们使用这种递送策略在体内制造基因编辑的CAR- T细胞，希望我们能够简化用于体外制造基因编辑的CAR -T细胞的复杂过程。”

未来发展方向及可达性

Doudna和她的实验室继续提高EDVs介导的递送效率。Hamilton曾是Doudna实验室的博士后研究员，她作为IGI“女性创业科学”项目的成员，正在进一步开发这种交付方法。该实验室专注于在体内起作用的载体的最终原因是使CRISPR疗法更广泛、更便宜。在《连线》杂志最近的一篇文章中，Doudna提到了当今昂贵的基因疗法的不公平，部分原因是患者接受骨髓移植时需要延长住院时间。

Doudna写道:“镰状细胞病的治疗预计将花费每位患者超过200万美元，美国只有少数机构拥有提供这种治疗的技术能力。”Doudna因共同发明CRISPR-Cas9基因组编辑而获得2020年诺贝尔化学奖。允许在体内提供基因编辑疗法和改进制造的新技术将是推动价格下降的关键，大学、政府和行业之间独特的合作伙伴关系也将以可负担性为共同目标。仅仅制造工具是不够的。我们必须确保它们能送到最需要的人手中。

参考文献:“In vivo human T cell engineering with enveloped delivery vehicles” by Jennifer R. Hamilton, Evelyn Chen, Barbara S. Perez, Cindy R. Sandoval Espinoza, Min Hyung Kang, Marena Trinidad, Wayne Ngo and Jennifer A. Doudna, 11 January 2024, Nature Biotechnology.