抗体发现可信赖的微流控平台——Cyto-Mine®高通量单细胞分析筛选系统

本文的研究旨在复制抗体发现（Antibody Discovery, AbD）工作流程的真实场景，在众多分泌抗体的细胞（Antibody Secrete Cell, ASC)中发现稀有的能分泌感兴趣抗体的单细胞亚群。然后使用基于微流控技术的全自动集成平台Cyto-Mine®(6)对这些稀有的抗原（Antigen, Ag）特异性单细胞进行鉴定、分离和亚克隆培养。此外本研究还评估了从Cyto-Mine®富集的抗原特异性小群体细胞的亚克隆，从而证明其在所有类型的AbD工作流程中适用。

Cyto-Mine®

能够通过不同的分子机制对抗多种疾病的抗体的发现和开发是药物发现的一个关键和快速增长的领域(1)。尽管有许多方法旨在检测和分离所需靶细胞，但该领域仍然面临相当大的挑战。因此，专注于检测和分离稀有单细胞的方法和工具正在不断发展，以提供应对这一挑战的最佳解决方案（2-5）。英国Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine®微流控单细胞分析筛选平台可很好地胜任AbD工作流程。所有的工作最快在4周左右的时间即可完成。改善了抗体发现的实验流程，大大加快了抗体发现的步伐。

Cyto-Mine®工作流程集成自动化地筛选、分选、分配和抗原特异性克隆验证。

Cyto-Mine® 工作流程

抗原特异性FRET实验

荧光共振能量转移（FRET）被开发用于提供针对抗原特异性ASC的特异性和敏感性检测。FRET供体（AF488标记的TNFα）与FRET受体（AF594标记的抗小鼠IgG）配对。这两种FRET探针仅在抗TNF α特异性小鼠IgG存在时结合并形成三分子复合物，在单细胞水平上提供敏感和高度特异性的分泌抗体检测。

基于FRET的Ag-特异性 ASC细胞检测示意图

Spike-in 实验

Spike-in实验旨在模拟AbD运动，把分泌感兴趣抗体的非常小的细胞群与分泌其他无关抗体的更大的细胞群混合。在这组实验中,使用一个小的分泌量递减的anti-TNFα抗体的细胞(靶细胞系)与一个大型的、混合固定数量的其他无关紧要的杂交瘤细胞（对照细胞系）,这些细胞的分泌水平相似但分泌的是不同的小鼠IgG。

结果和讨论

Cyto-Mine是一种检测和分离稀有分泌细胞的强大工具

Cyto-Mine检测稀有细胞群的灵敏度是通过Spike in实验确定的。实验首先评估了两种杂交瘤细胞系（Anti-TNF α分泌靶细胞和无关对照细胞）的分泌率，并根据FRET阳性信号和输入实验的细胞数量判断，证实两者具有相似的IgG分泌细胞比例(图1A：对照杂交瘤：40%；Anti-TNF α分泌型杂交瘤：38%)。

1A. Cyto-Mine®散点图显示不相关杂交瘤细胞系（左）通过一般IgG FRET试验检测到IgG分泌。TNF α特异性FRET试验未检测到信号（未示出）。采用Ag-特异性FRET法检测TNFα特异性细胞株（右）的分泌率。用普通小鼠IgG FRET法检测相似的分泌率（数据未显示）。分别对0.15e6和0.25e6输入细胞采用泊松分布公式计算分泌细胞比例。

接下来，用CellTracker Deep Red荧光标记靶细胞，将标记的分泌靶细胞与1 x 10⁶个对照细胞按数量递减混合。成功标记（图1B左，未混合的群体）并使用荧光显微镜检测这些细胞与对照未标记细胞混合后的检测情况（图1B右）。

1B. 分泌Ag-特异性 IgG的细胞用CellTracker Deep Red预染色（左），然后加入（1x10⁶）不相关的未染色细胞（右）。

图1C显示了使用Ag-特异性 FRET试验在Cyto-Mine®上检测到的分泌靶细胞数量减少的散点图。数据显示，FRET阳性门控细胞群的百分比明显减少，与预期的靶细胞数量相关。这些稀有的细胞在Cyto-Mine®平台上被圈中、分选并分配至96孔板。

1C. Cyto-Mine®散点图显示Ag-特异性分泌细胞（数量在散点图顶部显示）数量减少，加入固定数量（1x10⁶）的不相关分泌细胞。

然后使用NYONE孔板成像仪对板进行成像，以检测CellTracker Deep Red标记的靶细胞。下图显示了两个分配液滴的例子，都包含一个标记细胞，说明基于Ag-特异性FRET信号成功分离了稀有的分泌细胞。使用Cyto-Mine®在分配过程中提供的图像，可以识别不包含单细胞的孔（如下图左中的Example 2），确保多克隆孔在需要进行下游处理时不会被选择。

1D. 将Cyto-Mine®的细胞（左2例）分配到96孔板中，在板中成像，以获得CellTracker Deep Red染色（右）。

对所有实验进行分析，以确定在分配板中是否存在标记细胞（下表），统计分析显示准确度非常高（95-100%），证明Cyto-Mine®和FRET分析是检测、选择和分离AbD靶标的可靠和选择性工具。

1E. 表总结了所进行的实验和在所分配的孔中含有至少一个预染色细胞的孔的比例（分离精度）。CT：CellTracker Deep Red。在1000-10000输入范围的3个分配板上进行统计分析，而对于200-500个输入细胞，将所有检测到的阳性事件进行分选并分配。

稀有群体亚克隆/富集

以上内容演示了AbD工作流程，该流程模仿了在稀有原代分泌细胞上进行的实验，其中分离的靶细胞被分配到PCR板中进行下游分析。然而，AbD工作流程也可能涉及杂交瘤细胞的筛选、分离、亚克隆和高性能克隆的生长。为此，本研究使用了ASC分泌率降低的杂交瘤细胞系(4.14%；图2A)。Cyto-Mine®结合Ag-特异性 FRET测定，用于检测和分离含有FRET阳性细胞的液滴。以未分泌Ag-特异性抗体或空液滴的FRET阴性细胞为对照，与FRET阳性液滴一起分选。分配散点图和平板图显示，只有FRET阳性的液滴含有细胞（图2B），证明了FRET检测的特异性。接下来，将分配的细胞培养两周，结果有46.25%的单细胞生长（图2C）。

2A. 显示Cyto-Mine®上使用FRET试验检测到的Ag-特异性细胞系的分泌率（分泌群体<5%）。用普通小鼠IgG FRET法检测类似的分泌率（数据未显示）。对于0.15e6个输入细胞，采用泊松分布公式计算分泌细胞比例。

2B.门控液滴（FRET阳性）分选并分配到96孔板上。基于Cyto-Mine®成像分析的板图。绿色孔：单克隆液滴（仅1个细胞），红色孔：多克隆液滴（>1个细胞），黄色孔：空液滴。右侧显示的是示例图像。

根据克隆生长情况，选择24个克隆从96孔板升级到24孔板继续培养。对前12个克隆进行进一步放大，并使用基于孔板读数仪的FRET测定滴度。图2D显示了所选克隆的归一化数据（滴度归一化到细胞融合度），其中显示最高生产水平的克隆进一步突出显示（红框）。使用Cyto-Mine®进一步验证了最高产量克隆。来自Cyto-Mine®的数据表明，亚克隆培养使分泌细胞率提升了13倍（图2E，从4.14%增加到55.8%），从而强调了Cyto-Mine®在杂交瘤AbD应用中的相关性和特异性。

2C. 将分配的单细胞培养成克隆。将24个单克隆液滴（单细生长）培养的克隆转移到24孔板上进行后续生长和分析。示例的单克隆用红色框圈起来。

2D. 使用Ag-特异性FRET法和BMG Labtech Clariostar Plus孔板读数仪对12个克隆的上清进行分泌分析。最佳克隆的例子用星号突出显示。

2E. 用Ag-特异性FRET法对所选克隆进行Cyto-Mine®分析。对于0.15e6个输入细胞，采用泊松分布公式计算分泌细胞比例。

参考文献

1. Carter, P & Rajpal, A, Designing antibodies as therapeutics. Cell, 2022 Jul 21;185(15):2789-2805.

2. Parola, C et al. Integrating high-throughput screening and sequencing for monoclonal antibody discovery and engineering. Immunology 2018 Jan;153(1):31-41.

3. Pedrioli, A et al. Single B cell technologies for monoclonal antibody discovery. Trends Immunology 2021 Dec;42(12):1143-1158.

4. Nagano,K et al. Phage Display Technology as a Powerful Platform for Antibody Drug Discovery . Viruses. 2021 Jan 25;13(2):178.

5. Tejwani, V et al. High-throughput and automation advances for accelerating single cell cloning, monoclonality and early phase clone screening steps in mammalian cell line development for biologics production. Biotechnol Prog. 2021 Nov;37(6):e3208.

6. Josephides, D et al. Cyto-Mine: An Integrated, Picodroplet System for High-Throughput Single-Cell Analysis, Sorting, Dispensing, andMonoclonality Assurance. SLAS Technol. 2020 Apr;25(2):177-189

Cyto-Mine®平台特点

这些数据显示了Cyto-Mine®筛选大细胞群以发现、分类和分离高价值克隆的能力。该分析定量的免疫球蛋白浓度在标准生物制药工程细胞的分泌范围内。凭借其基于微滴的IgG分泌测定，Cyto-Mine®具有以下优势:

1 简单

一步自动化无缝流程，无需多种仪器

2 质量

挖掘和分离稀有、单个、有活力、抗原特异性分泌的细胞的独特能力

3 无菌

端到端无菌，一次性耗材和无动物源性(AOF)试剂

4 速度和效率

允许多个项目并行运行，为用户腾出时间进行其他活动

5 小型化

pL级的高通量筛选，微量分析试剂使用

6 可追溯性

拍摄并储存细胞分配前的图像，提供单克隆源性证据

基因有限公司是英国Sphere Fluidics在中国区域推广和销售的合作伙伴，在全国17个城市均有驻当地的办事处。可为您提供售前产品咨询与技术交流、售后安装、应用培训等优质服务。如果想了解更多关于Cyto-Mine的介绍，可以添加下方产品经理企业微信进行一对一沟通。

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