基于HiFi测序的多组学分析解析染色质可及性，阐述玉米转座元件的调控潜力

玉米转座元件（TEs）已成为玉米进化中不可或缺的组成部分，占玉米基因组的80%。在这里，研究人员证明了长读长染色质纤维测序（Fiber-seq）能够对玉米TEs的调控潜力进行全面的注释。

长读长染色质纤维测序Fiber-seq

玉米转座元件（TEs）已成为玉米进化中不可或缺的组成部分，占玉米基因组的80%。然而，TE的重复性阻碍了对其调控潜力的理解，尤其是受限于二代测序技术在重复序列上的表现（很少能特异性地绘制出TE）。在这里，研究人员证明了长读长染色质纤维测序（Fiber-seq）能够对玉米TEs的调控潜力进行全面的注释：

TEs的调控潜力：研究发现只有94个长末端重复（LTR）逆转录转座子包含转座所需的功能性表观遗传结构。这种表观遗传结构随着进化年龄的增长而退化，从而导致单个TE增强子同时被超CPG甲基化和染色质可及性标记，这种结构与典型增强子明显不同。

TEs对基因调控的影响：研究发现TE通过在TE内部创建新的启动子以及通过TE介导的基因扩增来塑造玉米基因调控。

特定位点的TEs：研究揭示了一种普遍存在的表观遗传密码，指导TEs到达特定的基因位点，包括McClintock发现的hAT TEs插入位点。

1. 利用Fiber-seq评估玉米调控潜力

Fiber-seq使用非特异性DNA N6-腺嘌呤甲基化酶来甲基化具有可及性的腺嘌呤（这是一种在植物中非常稀少的修饰），然后对约18 kb的玉米染色质纤维（chromatin fiber）进行单分子PacBio测序，从而能够同步检测可达腺嘌呤（m6A）和内源性胞嘧啶甲基化（5mCpG）。

图1A. Fiber-seq实验设计。

如上所示，研究人员使用从暗培养14天的玉米幼苗中分离的叶片原生质体的成对样本，比较了Fiber-seq和ATAC-seq（图1A）。研究人员观察到，Fiber-seq检测到的m6A和5mCpG在ATAC-seq检测到的可及染色质区域（ACRs）和CAGE定义的转录起始位点（TSSs）上显示了预期的信号，并且信号强度也与TSSs存在预期的相关性：通过在整个基因组中聚集FIRE元件（Fiber-seq Inferred Regulatory elements），FIRE-seq检测到了106,867个ACRs （FDR <0.01，图1B），ATAC-seq只检测到了51,817个 ACRs (q值<0.01)，因此Fiber-seq揭示了更全面的玉米调控潜力。Fiber-seq不仅可识别成对样本中绝大多数ATAC-seq检测到的ACR（图1B），还可识别低覆盖重复区域的新的ACR，并纠正假阳性的ATAC ACR，例如与质体或线粒体基因组同源的核基因组区域（图1C、D）。综上所述，Fiber-seq能够以单分子和单核苷酸的精度准确捕获玉米的染色质可及性和5mCpG。

图1B-D. Fiber-seq全面捕获玉米的调控潜力。

接下来，研究人员继续探究TEs中的ACRs，重点关注LTR逆转录转座子。因为LTR在玉米基因组中普遍存在（74.4%），且序列呈现高度一致性，确定其功能活性一直具有挑战性。完整的LTR逆转录转座子是I类TE，其双侧LTR被认为包含调控元件、启动子和邻近增强子，它们驱动内部编码的TE基因的表达（图2A， B）。基于Fiber-seq，研究人员绘制了位于玉米基因组中51,882个完整LTR逆转录转座子以及solo LTRs中的ACRs。发现玉米叶片仅含有94个LTR逆转录转座子（在双侧LTR中均包含两个相邻的ACR），这些转座子包含转座子移动所需的调控元件，其中只有76个是自主的LTR逆转录转座子。

大多数含有ACR的完整LTR逆转录转座子在一个或两个LTR中仅含有单个ACR（图2B）。单个ACR比成对ACR表现出更大的异质性。通过检测染色质可及性和5mCpG甲基化，研究人员发现染色质可及性和超5mCpG甲基化在LTR逆转录转座子的单个ACRs上共同发生，并沿着相同的染色质纤维直接重叠，表现出与染色质可及性直接相关的超5mCpG甲基化（图2B， D， E）。这两个表观遗传标记被认为是相互排斥的。然而，同时具有染色质可及性和超5mCpG甲基化的罕见ACR几乎全部存在于重复元件中，其中15%对应于完整LTR反转录转座子中的单个ACR（图2F）。这种染色质可及性和超5mCpG甲基化的意外共同发生在人类LTR反转录转座子中也是罕见的，且并未大量富集。

图2. 完整LTR逆转录转座子中的FIRE ACR可识别功能性逆转录转座子、TE衍生的调节元件和TE支持的宿主基因扩增。

然而，仅依赖公开的短读长测序数据很难进一步分析RNA介导的DNA甲基化或其他染色质状态在这些低覆盖位点上的典型甲基化特征。基于HiFi长读长测序的Fiber-seq很好的解释了这个问题：考虑到成对和单个ACR的特征，研究人员推断含有前者的LTR反转录转座子可能是进化上较年轻的TE，而含有后者的TE可能更老，但仍然比许多完全沉默的转座子年轻。最新确认的具有典型的染色质和CPG甲基化模式的LTR逆转录转座子则表现出会随着进化年龄的增长而退化。

2. TEs对基因调控的影响

长期以来，TE一直被认为通过添加或破坏启动子、增强子、绝缘子和编码区来塑造宿主基因调控。在人类中，TE衍生的启动子是通过转录起始位点和转录因子结合位点重叠TE序列的定位推断出来的。然而，在玉米中的分析受到TE固有的短读长低覆盖率问题的严重限制。因此，该研究中利用完整的玉米LTR逆转录转座子中FIRE ACRs的综合图谱来鉴定可能影响宿主基因调控的LTR。研究人员发现LTR FIRE ACRs影响的假定靶基因通常位于LTR逆转录转座子本身。比如，在B73中941个带ACRs的LTR逆转录转座子中，114个（12%）在完整的逆转录转座子中含有一个注释基因，比不带ACRs的LTR逆转录转座子多24倍（图2H）。总的来说，这些发现表明LTR影响玉米宿主基因调控的主要途径之一是LTR本身提供新的基因启动子元件，促进基因扩增。

3. 特定位点的TEs

一般来说，转座子在体外和体内都被证明优先插入可接近的染色质。然而，使基因组位点易于插入II类（DNA） TE，特别是hAT TE的表观遗传特征仍未得到解决。McClintock报道的第一个易受hAT TEs插入影响的基因是C位点，现在称为C1（colored aleurone 1）基因：C1基因表现出异常的弥散纤维序列染色质可及性（图3A），在所有基因中排名前5%（图3B），以及低5mCpG甲基化，在所有基因中排名后5%（图3C）。McClintock鉴定的其他具有hAT TE插入的基因也表现出弥漫性的Fiber-seq染色质可及性和低5mCpG甲基化，与基因表达都没有很强的相关性。通过分析B73基因组中包含hAT TE插入的位点表明这些是普遍存在的表观遗传标记，指导hAT TE的插入，包括McClintock博士最初报道的hAT TEs插入位点。

图3. hAT TE倾向于插入Fiber-seq检测到的弥漫性染色质可及性区域。

展望

当代玉米基因组由近85%的转座子组成。由于短读长对重复序列的覆盖不足，对转座子的研究离不开长读长测序技术。在这里，研究人员使用Fiber-seq来检测整个玉米基因组中的ACR，阐述了玉米TEs的调控潜力。由此可见，对不同玉米系、杂交系和祖先物种以及不同组织和条件的进一步Fiber-seq将有助于进一步阐明TEs在植物中的调控潜力，以及它们在塑造玉米基因组表达和进化中的作用。

参考文献：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.07.10.602892v1.full

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