Xenium单细胞空间原位分析：开启成像研究的全新视界！

在2020年的一项调查中，研究人员将mRNA图谱分析和高内涵成像列为最有可能改变游戏规则的两项技术。如今，大规模多重空间RNA分析（如空间转录组学）将这两项技术结合在一起，并放大了它们的优势。

我们通过这篇文章，不仅仅是为了说明这项技术将如何让您的研究受益，更是为了向您展示这一点。请看下图：

图1. 利用小鼠组织图谱分析基因组合通过Xenium原位分析技术分析完整小鼠幼崽的FFPE切片。

这并不是免疫荧光，而是利用Xenium原位分析技术分析的RNA。具体来说，这是1.77亿条转录本，来自整张组织切片上的140万个细胞，将它们结合起来可鉴定特定的细胞类型（用颜色表示），进而揭示特定的组织和结构。现在让我们来仔细看看：

图2. 利用Xenium Prime 5K分析和多模态细胞分割分析的FFPE小鼠结肠组织。

每个数据点都代表一条单独的RNA转录本。有了这些数据，再加上利用细胞分割功能以亚细胞分辨率同时分析成百上千个基因的能力，您不仅能够区分单个细胞，还能分析它们如何与邻近细胞通讯、特定的细胞邻域在健康和疾病中如何起反应等等。

阅读下文，看看Xenium如何带您更深入了解每张组织切片：

• 更好地表征细胞类型和状态

• 更深入地了解细胞如何相互作用和通讯

• 从样本中获得更全面的数据，同时不影响现有的分析物

01 多重空间基因表达分析解锁有关细胞类型和状态的更多信息

多重RNA检测通过测定每个细胞中成百上千个基因，更清晰地描绘出细胞类型和状态，帮助您找到感兴趣细胞类型的最佳标志物，以补充和增强现有工具。

细胞是根据它们表达的特定基因来定义的。过去，研究人员通常依赖单个（或少量的）标志物来表征整个群体。然而，这种方法存在一些风险，包括可能会为您感兴趣的细胞类型选择并非最佳的标志物，或根据单一标志物将异质性的细胞放在一起。

例如，GFAP是星形胶质细胞的经典标志物，但这类细胞在疾病和炎症发生时会分裂为多个群体(1)。单一或少量的蛋白标志物可能无法全面解析这些细胞状态，特别是当您事先不知道每种细胞类型（亚型）的标志物时。与蛋白质组学方法相比，基于大规模多重RNA的高内涵成像技术能够同时测定更多基因，并解析这些细胞状态（图3）。

图3. 利用Xenium人类肺部基因组合深入表征新鲜冷冻人类肺癌组织切片中的细胞类型。A. 图中绘制了肺癌样本（肺原位腺癌）中原生空间背景下的细胞类型（以不同颜色表示）。B. A图描述的细胞类型的聚类和标记。图片改编自Haga et al. 2023中的图6I。(CC BY 4.0).

图3展示的是Hega等人分析的肺癌切片(2)。利用Xenium人类肺部基因组合，研究人员能够观察每个细胞中的数十条转录本，然后利用这种多重基因表达数据对相似的细胞进行“分类”。他们为每种细胞类型分配了不同颜色，并绘制了它们在整个组织中的定位（图3A）。他们还能观察到不同的细胞类型是如何聚集在一起的（图3B）。这对于分析整张组织切片上的细胞邻域很有价值，但多重RNA分析还能带您了解更多（图4）。

图4. 利用Xenium对肺癌中的细胞亚型进行高分辨率可视化。A. 图中显示了图3中的部分肺癌样本，展示了各种肺部巨噬细胞和免疫标志物的空间分布和共定位。B. 图中显示了图3B中的部分组织，展示了各种免疫标志物在肺部巨噬细胞（MARCO+细胞）中的差异表达。图片改编自Haga et al. 2023中的图6J。(CC BY 4.0).

注：图4所使用的细胞分割是Xenium的早期版本细胞分割。目前首选的细胞分割方法是使用多种形态学染料对细胞边界和内部进行染色，并利用专门的算法进行准确分割。点击此处，了解最新的Xenium细胞分割方法的更多信息。

在同一张组织切片上，研究人员以肺部巨噬细胞标志物MARCO（黄色）为例，展示了高度多重RNA分析如何更好地区分细胞亚群。有了丰富的数据集，他们能够从头表征组织中各种不同的MARCO+肺部巨噬细胞。值得注意的是，其中两种亚型（FABP4+和SPP1+）具有潜在的临床意义，因为它们“……会影响附近的成纤维细胞，并可能导致肺泡塌陷，”这是一种与肺部结构和功能有关的宏观变化。

扩展到这种方法对您自己的工作也有好处：多重空间RNA分析让您能够观察更多基因，为您提供更多的数据点来鉴定组织中的细胞类型、状态和位置。这可以作为研究的终点，阐明组织的潜在生物学特征，也可以帮助您选择更好的标志物，以便开展更有针对性的蛋白质组学研究。

02 多重RNA分析更深入地描绘细胞如何联系和通讯

RNA通过更详细地描绘分子、细胞和组织层面上的活动来帮助您解析复杂的生物学。

细胞不仅会接触，也会交谈。了解单个细胞中的活动，其邻近细胞中的活动，以及它们如何作为一个整体进行通讯，对捕捉组织生物学的更大图像至关重要。

传统的方法通过分析几个标志物来进行邻域和配体-受体分析，但多重单细胞空间RNA分析将标志物数量提高了几个数量级，可帮助您扩大分析范围（图5）。

图5. 脊髓中多发性硬化病灶的Xenium分析。A. 各种与健康和疾病相关（DA）的胶质细胞在脊髓中的空间分布。B. 脊髓中的多发性硬化病灶“区室”内每个细胞的细胞间相互作用网络。图片改编自Kukanja et al. 2024中的图4A和图5C。(CC BY 4.0).

在这篇2024年发表的论文中，研究人员利用多重空间RNA分析来探究脊髓中的多发性硬化病灶(1)。首先，他们表征了脊髓内的细胞状态（图5A），并鉴定出与疾病相关（DA）的胶质细胞。接着，他们利用细胞邻近和基因表达分析建立了病灶“区室”内每个细胞的相互作用网络（图5B）。以此为基础的配体-受体分析提出了一个假设：DA小胶质细胞受到DA少突胶质细胞的调控，并导致多发性硬化症中这些（及其他）细胞类型的失调。

第二个例子来自非因生物（Fynn Biotechnologies），研究人员利用Xenium对免疫治疗后有应答和无应答的乳腺癌患者进行了比较(3)。利用Xenium人类乳腺基因组合提供的几百种标志物，他们能够表征多种细胞类型。在这些细胞类型中，只有两个细胞群（CTLA4+/CD8+效应T细胞和PD-L1+巨噬细胞）与应答患者的乳腺癌细胞共定位（图6）。

图6. 细胞共定位揭示了应答者特有的免疫细胞与癌细胞之间的相互作用。多个乳腺癌组织的Xenium分析表明，在对免疫治疗产生应答的患者中，特定的免疫细胞类型（红色、粉红色）与肿瘤细胞（蓝色）共定位。图片改编自Wang et al. 2024中的图5C。(CC BY 4.0).

将这一点应用于您自己的工作中：通过对单细胞的清晰分割，鉴定不同细胞类型的能力以及观察它们如何与其他细胞共定位，让多重空间RNA分析能够更广泛、更深入地揭示细胞间通讯，并更好地了解组织微环境。

03 多重RNA分析提供样本的更全面数据集，同时不影响现有的分析物

Xenium与组织切片上基于组织学和抗体的检测方法兼容，包括H&E染色、免疫荧光和免疫组化，能够实现真正的多维分析。

多重RNA分析很好。如果能保留现有的分析方法，从组织中获取更多信息，那就更好了。让我们来展示一下：

想象一下，上述视频是对您自己的组织样本进行的Xenium分析。与您现有的工作流程相似，组织已通过H&E和多种形态学染料（细胞核、细胞内部、细胞膜等）进行染色，然后成像。放大图像后，您可以关闭或打开H&E染色，查看组织的整体形态，或切换不同的形态学染料。

在此基础上，Xenium让您能够选择感兴趣的区域（最大可以覆盖整张组织切片），单独切换和观察多达5,000个基因的转录本，查看颜色编码的细胞类型和状态等。在经历过染色和Xenium流程的组织切片上，您还可以将这一功能与获取免疫荧光*（IF）数据（图7）以及基于Visium HD测序的空间转录组学数据的能力结合起来。将经典流程与RNA分析相结合，您可以从组织样本中获得更丰富的数据集，同时不会影响现有的分析物。

图7. 通过RNA和IF对阿尔茨海默病小鼠模型的脑组织进行分析。淀粉样斑块（白色）的IF周围存在与稳态和损伤相关的星形胶质细胞和小胶质细胞（分别为绿色和粉红色）。数据来源于应用指南《利用Xenium原位分析以亚细胞分辨率探索阿尔茨海默样病理》。

* 按照最新的技术指南，IF可在Xenium分析后进行，Watson等人在2024年的研究(4)中展示了在Xenium分析后的组织上实现多达16重的免疫荧光染色。

总之，在一张Xenium分析后的切片上，您可以开展IF以检测蛋白质，开展H&E染色以进行形态学分析，然后轻松地将这些结果与辅助图像配准相整合，同时观察这些输出结果。这种带有RNA信息的多组学方法为您的成像研究增添了一个全新的维度，同时让传统的分析物保持完整（如IF和H&E染色）。

04 结语：捕捉一张更大的图像

本文介绍的实验范例展示了多重空间RNA分析整合到成像研究中将如何为组织生物学提供变革性的见解，让研究人员在不影响现有分析物和方法的情况下更深入地了解细胞通讯、细胞类型和疾病机制。点击阅读原文，我们诚邀您探索示例数据集，看看它还能为您带来什么。

最后，尽管这篇文章重点介绍了基于成像的空间转录组学方法（如Xenium原位分析）的优势，但对于希望进一步增强组织研究的研究人员来说，我们还建议试试Visium HD（图8）。这种基于NGS的强大技术进一步补充了成像方法，提供了单细胞尺度的空间解析全转录组数据，并带来了整张组织切片上基因表达模式的更全面视图。您可以通过示例数据集亲身体会，或者更深入地了解这项技术。

图8. 利用Visium HD和H&E染色分析的人类FFPE结肠癌组织。人类结肠样本的Visium HD空间分析展示了精细的分辨率，并突出了整个组织内的异质性组织结构，同时还能利用H&E染色对同一张切片进行粗略的形态学分析。

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参考资料:

1. Kukanja P, et al. Cellular architecture of evolving neuroinflammatory lesions and multiple sclerosis pathology. Cell (2024). doi: 10.1016/j.cell.2024.02.030 

2. Haga Y, et al. Whole-genome sequencing reveals the molecular implications of the stepwise progression of lung adenocarcinoma. Nat Commun (2023). doi: 10.1038/s41467-023-43732-y

3. Wang N, et al. Spatial single-cell transcriptomic analysis in breast cancer reveals potential biomarkers for PD1 blockade therapy. Research Square (preprint) (2024). doi: 10.21203/rs.3.rs-4376986/v2

4. Watson S, et al. Fibrotic response to anti-CSF-1R therapy potentiates glioblastoma recurrence. Cancer Cell (2024). doi: 10.1016/j.ccell.2024.08.012