Western Blot 常见问题及解决方案

Western Blot 常见问题及解决方案

 1 背景过高 

原因

• 封闭不充分

• 一抗过浓

• 孵育温度过高

• 一抗二抗封闭剂间有交叉反应

• 洗膜不充分

• 膜过于干燥

对策

• 延长封闭时间或更换封剂

• 稀释一抗

• 4℃孵育

• 加入Tween-20，以减少交叉反应

• 设二抗对照，稀释二抗

• 增加洗膜次数

• 避免干膜

 2 无条带或太弱 

原因

• 一抗二抗选择错误

• 一抗二抗浓度过低

• 一抗失效

• 蛋白含量过低

• 转膜不充分或洗膜过度

• 过度封闭

• 二抗受叠氮钠抑制

• 底物与酶失效

• 曝光时间过短

对策

• 选择正确抗体

• 检查抗体和显色试剂盒保质期

• 提高样品蛋白含量

• 设内参对照，转膜对照

• 转膜效果的检查

• 减少洗膜时间

• 降低封闭液浓度，减少封闭时间

• 延长曝光时间

 3 杂带过多 

原因

• 蛋白样本具有多种修饰

• 蛋白样本降解

• 蛋白存在二聚体或多聚体

• 一抗二抗浓度过高

• 多克隆抗体

对策

• 使用去修饰的试剂

• 使用蛋白酶抑制剂

• 电泳上样前，煮沸10 min，以增强蛋白质解聚变性

• 降低抗体浓度

• 选用单克隆抗体

 4 其他问题 

• 背景白色条带 → 转膜时有气泡或抗体分布不均

• 暗片现白条带 → 一抗或二抗加入过多

• 目的条带过低/过高 → 胶浓度不合适

• “微笑”条带 → 迁移过快、电泳温度过高

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