介绍 甲病毒是阳性单链RNA病毒，可引起严重的人类和动物疾病，包括危及生命的脑炎和持续性关节炎( 1， 2）. 基孔肯雅病毒（CHIKV）是引起关节炎的甲病毒的一种。人类感染千伏病毒会引起发烧和皮疹，并伴有严重的肌肉和关节疼痛，可持续数年( 3 - - - - - - 5)，并可引致致命的脑炎( 6）. CHIKV是由 伊蚊 蚊子已经遍布全球。目前在美洲、非洲和亚洲流行，2023年报告的约50万例患者中，大多数位于中美洲和南美洲（欧洲疾病预防控制中心，2023年12月）。 7 - - - - - - 12）. 由于其蚊媒的传播，以及病毒对新病媒的适应，预计受CHIKV及其他甲病毒感染的个案将继续在全球上升( 8， 9）. 尽管存在这一重要的健康负担，但目前没有批准用于治疗任何人类甲病毒感染的抗病毒药物，只有一种经fda许可的CHIKV疫苗（Ixchiq） ( 13）.
甲病毒基因组编码两个开放阅读框，一个用于复制病毒基因组的非结构蛋白（nsP1-4），另一个用于形成病毒颗粒的结构蛋白：衣壳蛋白（Cp）、p62 （E3和E2的前体）、6K/转框（TF）和膜融合蛋白E1（2,14,15）。在成熟的病毒粒子中，病毒RNA基因组被包装在一个240 Cp的壳中，形成核心核衣壳（NC）。在质膜出芽期间，NC被宿主细胞衍生的脂质膜包裹，脂质膜上布满了80个由E2-E1二聚体三聚体组成的病毒尖刺（16,17）。这些尖刺通过E2的细胞质结构域与Cp中的疏水袋结合而固定在潜在的NC上，这种相互作用对病毒出芽至关重要（18）。甲病毒感染是由E2-E1尖刺引发的，E2-E1尖刺介导细胞表面附着和受体结合，从而通过网格蛋白介导的内吞作用促进病毒摄取（19-26）。内体低pH触发E1膜融合蛋白，介导病毒-内体膜融合，将NC释放到宿主细胞质中（2,23,27）。非结构蛋白被翻译成病毒RNA复制复合体，结构蛋白被表达为多蛋白。Cp会自动催化地从新生的多蛋白链中分离出来，留在细胞质中，并包裹住病毒基因组，从而形成NC（28,29）。其余的结构蛋白被转移到内质网中，p62与E1形成稳定的异源二聚体。在通过分泌途径运输的过程中，p62被细胞蛋白酶furin切割成成熟的跨膜E2和外周E3。糖蛋白随后被运送到病毒颗粒组装和出芽发生的质膜上（14）。病毒出芽需要Cp与E2细胞质内结构域之间1:1的相互作用（30,31）。特定E2残基突变，包括一个保守的酪氨酸(SFV E2 Y399R；SINV E2 Y400K)，可以阻止Cp-E2相互作用和出芽（18）。
几种甲病毒，包括CHIKV和Semliki Forest病毒（SFV），诱导从受感染细胞发出并稳定附着在邻近细胞上的臂状延伸的形成( 32）. 这些细胞间长延伸（ILEs）至少有10μm长，包含肌动蛋白和微管蛋白，并且是封闭的，ILE和靶细胞之间没有细胞质或膜的连续性。ILEs可以在多种哺乳动物细胞系中形成，包括Vero（非洲绿猴肾）、U-2 OS（人骨肉瘤）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC），尽管已经观察到一些细胞系特异性差异( 32， 33）. 在细胞培养中，ILEs已被证明可促进CHIKV病毒的细胞间传播，这种传播可抵抗高浓度的强效中和单克隆抗体（mAb chCHK-152） ( 33）. 在活的有机体内 结果表明，chCHK-152可阻断小鼠直接接种病毒感染。相比之下，感染了chikv的mef的过继性转移产生了抗体抗性病毒感染，支持ILEs在细胞间传播中的作用 在活的有机体内 ( 33）.
我们目前对肠内感染形成机制的了解仍然有限，而且肠内感染对CHIKV毒力和/或人类CHIKV感染的潜在贡献尚未得到解决。先前的研究表明，病毒结构蛋白的表达是诱导ILEs形成的必要和充分条件，排除了nsPs或病毒感染本身的重要作用（32）。虽然病毒出芽对于ILE的形成是不可缺少的，但病毒Cp及其与E2蛋白的相互作用是必不可少的（32），而NC组装和包膜蛋白表达的要求尚不清楚。为了解决这些知识上的空白，我们使用了特征明确的病毒突变体和特异性抗chikv单克隆抗体的组合。我们的研究结果表明，虽然病毒6K和转框蛋白以及细胞质NC的形成对于ILE的形成是必不可少的，但病毒E2和E1蛋白都参与其中，并且针对这些包膜蛋白的特异性单克隆抗体可以减少ILE的形成。我们发现，在所有四个主要的CHIKV谱系中，包括181/25减毒株，形成ILEs的能力都是保守的。虽然ILEs在人类CHIKV感染中的作用尚不清楚，但我们描述了人类CHIKV患者产生的抗体可以显著减少培养的人类细胞形成ILEs的第一个证据。
结果 核衣壳的细胞质预组装对于ILEs的形成并不是必需的 虽然Cp表达及其与E2的相互作用对ILE的形成至关重要（32），但Cp-Cp相互作用和NC细胞质预组装的要求尚不清楚。为了解决这个问题，我们用野生型（WT） SFV或SFV MXI感染了Vero细胞，SFV MXI是一种SFV突变体，在Cp位置M（113）和I（115）上含有丙氨酸取代（图1A）（34,35）。这些突变已被证明会破坏Cp-Cp相互作用的稳定性，并阻止NC的细胞质预组装。尽管存在NC装配缺陷，SFV MXI突变体仍能存活，产生的感染性病毒颗粒滴度仅降低了10倍，NC结构正常（35）。这些数据共同支持一个模型，即Cp MXI组装成NC是由与质膜上的包膜蛋白晶格相互作用驱动的，从而促进病毒出芽（35）（图1B，并参见（36））。我们在感染后8小时（hpi）用共聚焦显微镜定量了ILE的形成，发现SFV MXI感染诱导的每个细胞的ILE数量相当（每个细胞的平均ILEs数±sd）： 2.5±0.1)与WT SFV对照组（2.2±0.2）的感染（图1B和C）相同。因此，细胞质预组装NC和Cp MXI基序对于ILE的形成都不是必需的。
ILE的形成不需要p62的裂解 p62前体在分泌途径中被细胞蛋白酶furin切割成成熟的E2和E3（37,38）。为了测试未成熟p62是否可以诱导ILEs，我们使用了对furin不敏感的SFV突变体L (mutL)，该突变体在furin切割位点上有一个精氨酸取代了亮氨酸（39）。SFV多芽在病毒融合和感染中被强烈减毒的未成熟病毒颗粒（38,40,41）。为了规避感染阻断，我们评估了编码野生型（pSFV WT）或多型（pSFV p62 mutL） SFV结构蛋白的质粒诱导的ILE形成（图1D）。作为阴性对照，我们表达了含有E2 Y399R突变的SFV结构蛋白（pSFV E2 Y399R），该蛋白阻断E2- cp相互作用（18），并且在ILE形成中存在缺陷（32）。我们用pSFV构建体转染Vero细胞，培养24小时，并对ILE形成进行评分（图1E和F）。我们的结果表明，WT和mutL具有相似的ILE形成水平（WT 0.9±0.4和mutL 0.9±0.3每个表达细胞）。与先前的结果一致，E2 Y399R突变体诱导的ILEs显著减少（0.2±0.1）。
6K和transframe对于ILE的形成都不是必需的 甲病毒结构蛋白Cp- e3 -E2- 6k /TF-E1足以形成ILE，而Cp和E2是必需的（32）。然而，小膜蛋白6K和转框蛋白（TF）的作用目前尚不清楚。这一点尤其重要，因为6K被认为支持E2/E1峰成熟和Cp-E2相互作用（42,43）。6K和TF共享相同的n端，但由于产生TF的内部移帧事件，它们的c端氨基酸序列不同（参见文献43）。
在细胞培养中，6K和TF都不是感染所必需的 6 k 序列降低病毒出芽、生长和融合能力( 43 - - - - - - 45）. 为了避免6K/TF缺失病毒的这些混淆效应，我们产生了一种表达SFV WT结构蛋白但缺乏整个6K和TF编码区的质粒（pSFV Δ6K/TF） ( 图2一个）. 我们用pSFV Δ6K/TF、pSFV WT构建体或对照质粒（pcDNA3.1(?)）转染Vero细胞，并在24 hpt ( 图2B和C）. 无论6K和TF是否表达（pSFV WT: 1.0±0.2），转染的细胞每个细胞形成的ILE数量相似（pSFV Δ6K/TF: 0.9±0.3），表明6K和TF对于ILE的形成是不可缺少的。鉴于已报道的6K对病毒出芽和穗成熟的贡献( 43)，这一结果与已发表的观察结果一致，即ILE的形成不需要病毒出芽( 32）. 这进一步表明6K对Cp-E2相互作用的贡献对于ILE的形成可以忽略不计。
抗体与E2结构域A的相互作用可减弱ILE的形成 为了更详细地了解p62/E2在ILE形成中的作用，我们接下来关注的是单个E2结构域的贡献。成熟的E2包含一个外域，它被细分为三个结构域：一个中心结构域a，由β带连接器连接到E2尖端的结构域B和膜近端结构域C，它通过子结构域D连接到跨膜锚点和内结构域( 图3A和B） （ 46， 47）. 为了分析单个E2结构域的重要性，我们测试了7种具有良好特征的抗CHIKV E2单克隆抗体对人U-2 OS细胞ILE形成的影响( 图3）. mAb的结合位点如图所示 图3A和B，其中详细介绍了用于定义单抗结合位点和功能作用的检测方法 表S1。简而言之，chCHK-152单抗结合在单个E2单体内E2结构域A和B上的残基( 48 - - - - - - 51）. 马伯C9 pMAZ 在三聚体内部和/或之间通过两个E2单体结合，与E2结构域a和B上的残基相互作用( 16， 50， 52， 53）. 单克隆抗体ch-m242、K9-1和D3-62结合E2结构域A内的残基( 49， 54， 55) （T. Couderc和M. Lecuit，未发表数据）。单克隆抗体chCHK-265和DC2。M108结合E2结构域B ( 48， 56 - - - - - - 58）. 我们用ELISA法证实，所有单克隆抗体都能结合到感染了CHIKV 181/25 GFP的人U-2 OS细胞表面( 无花果S1。）. 基于它们的半极大结合（EC） 50 )值，单克隆抗体聚集成两组：强结合物，包括DC2。M108（0.004μg/mL）、chCHK-152（0.004μg/mL）、D3-62（0.004μg/mL）、K9-1（0.011μg/mL）和中等粘结剂C9 pMAZ (0.631μg / mL), ch-m242(1.62μg / mL),和chchk - 265(2.45μg / mL)。为了检测抗体对细胞ILE形成的影响，我们用CHIKV 181/25 GFP （MOI）感染U-2 OS细胞 u - 2操作系统 0.25)，然后从2 hpi开始，在20μg/mL指示的Ab中培养细胞。与测定的EC相比，该标准单抗浓度高出8- 4000倍 50 用于细胞表面结合。在有Ab存在的情况下，让感染进展9小时，用共聚焦显微镜在11 hpi下定量ILEs ( 图3C、D’）. A/B结构域靶向单克隆抗体chCHK-152（1.6±0.4,mean±sd）和C9均无明显差异 pMAZ （1.1±0.0），B域特异性单克隆抗体chCHK-265（1.0±0.2）和DC2。与无Ab对照（1.0±0.1）相比，M108（1.5±0.4）显著减少了ILE的形成( 图3 c）. 然而，这三种结合结构域A的单克隆抗体均显著降低了每个感染细胞形成的ILEs数量：ch-m242适度（0.8±0.1），K9-1和D3-62强烈（0.3±0.1和0.2±0.1）。因此，这些数据表明E2结构域A在ILE形成中的重要作用。
在没有E1表达的情况下，ILEs不会形成 在感染细胞中，p62/E2与病毒融合蛋白E1形成稳定的异源二聚体。虽然我们的数据支持p62/E2（及其与Cp的关联）在ILEs形成中的关键作用，但E1的重要性尚不清楚。因此，我们测试了在没有E1表达的情况下，ILEs是否可以发展。由于E1对病毒融合至关重要，因此E1缺失病毒不具有传染性。为了绕过这个问题，我们用WT结构蛋白（pSFV WT）或缺乏E1编码区（pSFV ΔE1）的表达构建体转染了Vero细胞（图4B）。在24 hpt时定量检测ILE的形成（图4A和C）。E1表达的缺失阻断了ILE的形成（pSFV ΔE1转染细胞为0.1±0.1 ILE/细胞，pSFV WT表达为1.0±0.2 ILE/细胞）。这种ILE形成的缺陷不是由于病毒融合的抑制，因为SFV（32）和CHIKV（图S2）的融合缺陷突变体诱导ILEs的水平与WT相似。注意，虽然ILE形成本身独立于病毒融合，但通过ILE介导的细胞间传播感染靶细胞需要病毒的内吞摄取和低ph触发的融合（33）。
先前的研究表明，E1是病毒出芽和E2的某些翻译后修饰所必需的，但不是p62/E2正确折叠、切割和转运到质膜所必需的（59-63）。我们使用流式细胞术直接定量E2在E1表达或不表达的质膜上的水平（图4D和E）。将WT或ΔE1-transfected细胞分成透性和匹配的非透性样品，分别检测E2的总水平或细胞表面水平。用于检测E2-1的mAb（64）在没有E1表达的情况下识别E2（图4D），这表明E2折叠成与E1表达无关的抗原相关构象。E1的缺失并未显著降低E2的总体表达（图4D，左），但增加了细胞表面E2的水平（图4D，右）。病毒结构蛋白的单独表达导致病毒样颗粒（vlp）从质膜出芽（55），从而从细胞表面去除包膜蛋白。因此，ΔE1-transfected细胞中VLP出芽的缺陷（61）可能导致E2的积累。综上所述，即使在质膜E2水平升高的情况下，ILEs也不会形成，这表明E1要么是ILE形成的直接需要，要么它支持E2结构和/或促进ILEs的翻译后修饰的重要方面。
E2-E1二聚体稳定性的扰动不会减弱ILEs的形成 为了更直接地解决E1的贡献，我们接下来测试了E2-E1异源二聚体稳定性的变化是否会影响ILE的形成。我们用两种特征良好的SFV突变体感染Vero细胞：E2 T12I稳定E2- e1二聚体，E2 R250G破坏二聚体（65,66）。在8 hpi下对ILEs的分析显示，两个突变体诱导的每个细胞的ILEs数量都与SFV WT对照组没有显著差异（图4F和G）。这一结果表明，E2- e1二聚体的稳定性和E2 T12或R250残基在ILE的形成中都不起核心作用。
Ab与特定E1结构域的相互作用可减弱ILE的形成 E1的完全缺失干扰了感染的多个方面，因此，我们无法最终确定E1在ILE形成中的作用( 图4）. 我们之前的结果表明，两种针对CHIKV E1蛋白的单克隆抗体可减少MEFs中ILE的形成（从而减少细胞间传播）( 33）. 在这里，我们用CHIKV感染人U-2 OS细胞，并在区域特异性抗e1抗体存在的情况下检测ILE的形成。E1外结构域包含三个结构域：中央结构域I (DI)，顶端有融合环的细长DII，以及通过短茎连接到螺旋TM结构域的膜近端DIII ( 67， 68）. E1外结构域与病毒膜切向，并以“交叉手指”状异二聚体的方式与E2外结构域结合( 图3A和4A） （ 47， 69）. DII上的融合环被E2结构域B屏蔽，E2和E1 TM结构域在膜上结合( 47， 69）. 为了剖析E1结构域的作用，我们使用了三种抗chikv E1单克隆抗体：两种结合E1 DII中靠近融合环的不同残基（chCHK-166和DC2.112） ( 48， 51， 70)，另一个与E1 DIII结合（T. Couderc和M. Lecuit，未发表数据）( 图5A、B； 表S1）. 这三种单抗均与感染CHIKV 181/25 GFP的人U-2 OS细胞表面结合。 S3无花果。)，并按他们的EC分类 50 强结合剂DC2.112 （0.011 μg/mL）和chCHK-166 （0.005 μg/mL）或中结合剂E10-18 （0.233 μg/mL）。与E2单克隆抗体试验类似，我们用CHIKV 181/25 GFP （MOI）感染人U-2 OS细胞 u - 2操作系统 0.25)，在2 hpi下加入20μg/mL mAb，在11 hpi下共聚焦显微镜( 图5C、D）. 如先前在感染chikv的mef ( 33)，单克隆抗体E10-18和chCHK-166显著降低了每个感染细胞形成的ILEs数量（分别为0.3±0.1和0.1±0.0，而对照组为1.0±0.1）。尽管mAb DC2.112与chCHK-166在E1结构域II上结合了一个空间相似的表位，但它并没有减弱ILEs的发展（1.2±0.3）。综上所述，这些数据表明Ab与E1结构域DII或DIII特定区域的相互作用可以减弱ILE的形成。
单克隆抗体通过屏蔽特定的尖峰区域来阻断ILE的形成 因此，我们已经鉴定出三种抗e2单克隆抗体（ch-m242、K9-1和D-62）和两种抗e1单克隆抗体（chCHK-166和E10-18），它们可以减少ILE的形成（图S6A和B）。ILE的成功形成需要两个基本但却不太了解的步骤：(i)延伸本身的发展，通过主动生长或感染细胞从靶细胞移动（32）和（ii）延伸尖端稳定附着在靶细胞上。虽然这些步骤的潜在机制尚不清楚，但我们的研究结果表明，ILEs的形成需要在细胞表面可访问特定的E1和E2表位。我们推断，抑制性单抗可以通过立体阻碍进入必要的尖峰区域或通过减少细胞表面E2-E1蛋白的数量来发挥作用。这种细胞表面蛋白的下调已经被观察到，抗体通过交联其靶蛋白并触发其从细胞表面的内吞清除（71-73）。不能交联的单价Ab片段，如抗原结合片段（Fab）或单链可变片段（scFv），不会诱导其靶蛋白的内吞和降解。与无Ab对照相比，两种il -衰减单克隆抗体K9-1和D3-62引起了病毒E2染色的变化（图3D无Ab vs图3D’）。这个不完整的外观可能代表mAb-mediated E2的交联,我们测试了如果K9-1和d3 - 62的晶圆厂马伯或者scFv E10-18马伯保留能够抑制ILE形成CHIKV-infected u - 2侦察机OS细胞(图6 a和B)。晶圆厂和scFv显著降低ILEs形成每感染细胞的数量相比没有Ab控制(图6 a和B)。这一结果表明抗原决定基掩蔽Ab-mediated抑制ILE形成的主要机制。
形成ILEs的能力在四个主要的CHIKV谱系中是保守的 许多病毒，包括CHIKV，进化出逃避宿主免疫反应的机制，从而在其（人类）宿主内成功复制和传播（74,75）。在细胞培养中，ILEs允许CHIKV在中和抗体存在的情况下有效地在细胞间传播（33），这表明ILEs可能有助于人类患者的CHIKV毒力。
CHIKV分为四个主要谱系：西非（WA）；东非、中非和南非（ECSA）；印度洋（IOL）；和亚洲。到目前为止，我们的实验主要集中在亚洲CHIKV减毒株181/25上。为了解决是否在所有四个谱系中，包括医学上相关的毒力菌株中，诱导ILE的能力是保守的，我们比较了181/25的ILE形成与其毒力亲本菌株AF15661[另见文献（33）]、ECSA菌株S27、IOL菌株larsamuunion 2006和WA菌株37997（图7）。出于生物安全性考虑，我们在Vero细胞中仅通过表达各自的CHIKV结构蛋白来诱导ILE形成。在没有感染的情况下（图7B和C）。所有测试的菌株在每个细胞中诱导的ILEs数量相当，与毒力和谱系无关。AF15661和181/25菌株（都是亚洲谱系）在5个氨基酸上不同，两个E2取代，G82R和T12I负责衰减（76）。我们关于二聚体稳定性的数据排除了E2 T12I对ILE形成的影响（图4G）。从亲代E2甘氨酸82到精氨酸82的变化映射在E2结构域A内，但我们的结果（图7）表明，虽然这种取代影响毒力（77），但它不影响ILE的形成。总之，我们的数据表明，在所有四种CHIKV谱系中，诱导ILEs的能力是CHIKV感染的一个保守特征，可能是抗病毒干预的医学相关靶点。
在小鼠中，从循环中有效清除CHIKV需要细胞清道夫受体MARCO与保守的E2结构域B残基K200相互作用。E2 K200的突变消除了与MARCO的相互作用，从而阻止了CHIKV的清除，导致病毒血症增加（79,80）。我们测试了marco介导的抗清除性CHIKV 181/25 E2 K200A突变体（81）是否会诱导ILEs数量增加。CHIKV 181/25 WT与E2 K200A的比较显示，ILE的形成没有显著差异（图S4）。这与我们的发现一致，mab结合E2结构域B对ILE的形成没有影响（图3）。
恢复期CHIKV患者的血清或血浆可减少ILE的形成 到目前为止，ILEs只在细胞培养中直接观察到。然而，来自感染了CHIKV的小鼠的数据表明，ILEs也会形成 在活的有机体内 它们有助于抗抗体病毒在小鼠体内传播( 33）. 在人类患者中，CHIKV感染急性期的特征是高烧、皮疹和严重的关节和肌肉疼痛（见参考文献） 82）. 在感染后的几天内，患者会产生强大的抗体反应，这对于清除病毒和防止将来出现症状性再次感染至关重要( 83）. 由于特异性纯化的抗CHIKV单克隆抗体减少了ILE的形成，我们测试了恢复期人类CHIKV患者的血浆或血清是否同样可以抑制ILE的形成。感染CHIKV 181/25的U-2 OS细胞以1:10 00 ( 图8)或1:100 ( 无花果S5。)稀释热灭活血清（“s”）或血浆（“p”）从恢复期的人CHIKV患者。患者队列1包括多米尼加共和国一名感染吉kv病毒的女性患者的血清和血浆( D ominican共和国, C HIKV: DC2) ( 51）; 患者队列2包括来自波多黎各感染CHIKV的两名女性和四名男性患者( P uerto Rico, C HIKV;PC1-6)。将CHIKV患者样本与无抗体对照（无抗体）、人对照血清（甲型流感和CHIKV血清阴性）和甲型流感病毒（IAV）疫苗血浆进行比较。结果显示，所有CHIKV患者的血清或血浆均能显著降低ILE的形成，且与年龄和性别无关( 图8B、D）. 抑制作用仅针对来自CHIKV患者的血浆/血清，没有任何对照样本引起显著降低。因此，在自然CHIKV感染期间诱导的人抗体可以抑制细胞培养中ILE的形成。
讨论 甲病毒感染培养细胞可诱导形成长丝状延伸，介导细胞间传播，使病毒不被细胞外抗体中和( 32， 33）. 我们最近在小鼠模型中的发现也支持ILEs和细胞间传播对CHIKV感染的贡献 在活的有机体内 ( 33）. 然而，尽管人们逐渐认识到ILEs在CHIKV感染中的作用，但我们对它们的形成和病毒蛋白需求的理解是有限的。先前的研究表明，仅表达病毒结构蛋白即可诱导ILE的形成，并且需要Cp及其与E2的相互作用( 32）. 在这里，我们使用一组特性良好的SFV突变体和抗chikv单克隆抗体，定义了E2、6K/TF和E1蛋白对培养细胞中ILE形成的贡献。结构蛋白6K和TF对于ILE的形成是不可缺少的。相比之下，我们的数据表明E2和E1对于ILEs的形成至关重要，并突出了E2结构域a的核心作用。重要的是，我们还证明，不仅纯化的抗CHIKV单克隆抗体可以减弱ILE的形成，而且可以通过康复期人类CHIKV患者的血清来减弱ILE的形成。
由于ILE和靶细胞之间没有膜连续性（32），接触部位必须紧密密封，以介导所观察到的病毒粒子对高浓度中和性抗体的屏蔽作用（33）。这表明“配体/受体”对的存在使两个细胞膜非常接近，类似于紧密或粘附的连接。ILEs仅起源于感染/病毒结构蛋白表达细胞，但可以附着在感染/表达细胞或na?ve细胞上（32）。我们的数据表明，ILE上的配体由E2-E1组成，当关键的表位被单克隆抗体掩盖时，ILE的形成受到阻碍（图S6A和B），这表明甲病毒结构蛋白不仅仅提供促进细胞骨架重塑的信号，而是直接介导促进稳定ILEs的细胞间相互作用。
虽然它们是必需的，但单独的病毒刺突蛋白不足以形成ILE：我们目前和先前的数据表明，Cp及其与E2的相互作用也是必不可少的，独立于它们在病毒出芽中的功能( 32）. 这里的几个观察结果进一步支持了这一点：尽管6K/TF的缺失会导致强烈的出芽缺陷( 43)，但并未减弱ILE的形成。的制备过程 pMAZ 单抗通过相邻刺突的二价桥接防止病毒出芽，从而增加刺突之间的距离并阻断膜曲率( 16， 50， 52， 53）. 该单抗不减弱ILE的形成。由于出芽和质膜曲率对ILE的形成都不是必需的，因此Cp-E2相互作用对ILE形成的精确机制贡献仍有待确定。根据我们目前的研究结果，我们假设Cp在特定的方向上聚集或组织E2-E1三聚体，使尖峰具有“ILE-competent”。
靶细胞上潜在的相互作用伙伴目前也不清楚，包括它们是否可能直接与E2-E1相互作用。CHIKV受体MXRA8或硫酸肝素蛋白聚糖在靶细胞上似乎没有作用（32,33），靶细胞伴侣的身份仍然是一个重要的问题。
我们的单抗数据显示E2结构域a在ILEs的形成中起核心作用，而E2结构域B单抗均不影响ILE的形成（图S6A和B）。结合E2结构域a单抗最有效地破坏ILE的形成，E2结构域a单抗结合邻近结构域B的E2 β-连接器附近的表位（即单抗K9-1， D3-62, ch-m242）。由于并非所有的抗体对E2结构域A都能减弱ILE的形成，因此可能只需要E2结构域A的特定区域，或者A的掩蔽受到Ab结合角度或其他Ab性质的影响。虽然具体的残基和区域仍有待确定，但我们的数据强烈支持E2结构域a在ILE形成中的作用，这与该结构域位于三聚体尖峰顶端的位置保持一致，在那里它很容易与靶细胞相互作用（图S6A和B）。
我们的数据显示，除了E2， E1也是ILE形成所必需的。这与E2和E1在异源二聚体结构中的密切关联（47）以及它们经常共同参与受体相互作用（84,85）是一致的。与我们对E2单抗的研究类似，我们测试了几种E1单抗对ILE形成的影响。我们在这里证实了mAb E10-18能有效地减弱ILEs的形成（33），并且表明该Ab的scFv也能强烈抑制ILEs的形成。mAb E10-18结合E1结构域III并改变E2结构域A的取向（F. Rey， T. Couderc, and M. Lecuit，未发表数据）。结构域III在穗状三聚体中至少部分可达，并且是SFV中VLDLR受体结合的位点（20）。因此，这些数据表明mAb E10-18通过其对E2蛋白的作用抑制ILE的形成。我们还发现chCHK-166有效地减弱了ILE的形成，这与我们之前的结果一致（33），而E1 mAb DC2.112没有抑制作用。这两种单克隆抗体都结合在E1结构域II的融合环附近，并且据报道具有部分重叠的表位（70）。然而，虽然两种单克隆抗体都能有效结合感染细胞表面的E1，但只有chCHK-166能有效结合并中和病毒颗粒（48），而DC2.112颗粒识别需要病毒暴露于酸性pH（70）。由于在尖峰的中性pH构象中，融合环被E2相对屏蔽，我们推测chCHK-166的结合会破坏融合环与E2的相互作用，而DC2.112的结合则不会。chCHK-166和E10-18与E1的相互作用相对于它们对E2异二聚体伴侣的影响对ILE形成的相对重要性将是重要的探索。
在本研究中，我们检测了少量抗chikv单克隆抗体（DC2.112, DC2）。M108,制备过程 pMAZ )，发现没有一种能抑制ILE的形成。作为一种更广泛的方法，我们检测了7名康复期人类CHIKV患者的血清，发现所有7份样本都能在细胞培养中减弱CHIKV诱导的ILE形成。这种效果是特异性的，因为iav免疫和未感染的对照样品都没有引起任何显著的ILEs抑制。这是首次有证据表明，在感染CHIKV病毒期间，人可以产生抗体，在细胞培养中减弱ILE的形成。这种阻断抗体的流行程度和它们在疾病期间发生的时间点仍有待确定。
总之，我们的数据支持一个工作模型，其中三聚体E2- e1尖峰，由E2与Cp的相互作用组织，促进ILE尖端与其靶细胞之间的附着，由E2结构域a与未知伴侣蛋白的相互作用介导。该模型和我们的结果提出了一些有趣的问题，包括E2-E1介导ILE尖端与靶细胞的局部、空间限制的附着的机制，维持这些稳定的细胞-细胞接触的机制，以及靶细胞上潜在相互作用伙伴的身份和功能。解决这些问题也将有助于描述协调ILE内稳定接触和细胞骨架戏剧性重塑的机制，这些机制目前尚不清楚。对甲病毒ILE的进一步研究将揭示这些机制。它们还可能有助于确定ILE在人类甲病毒感染中的功能重要性，以及抗体和疫苗针对它们的能力。
材料与方法 人类的样本 患者队列1的人类样本由Jonathan Lai博士提供。患者DC2如前所述（51）；IAV血浆取自健康的IAV疫苗接种者；健康人捐献CHIKV/IAV双阴性对照血清；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测样品的免疫状况。队列2的人类患者样本由William Messer博士提供。六种编码血清样本和相关人口统计数据的提供没有共享MTA# 000316-2024中规定的任何受保护的健康信息。在波多黎各，通过PCR或IgM/IgG血清学（作为波多黎各圣胡安市疾病预防控制中心社区血清调查的一部分）确定了恢复期CHIKV患者。样本采集于2023年8月至10月，按照批准的IRB协议# 10212的规定进行。所有的研究参与者在抽血时都是健康的；已知患者2和6分别于2014年6月和11月感染了CHIKV。由于2014年4月至9月期间在波多黎各发生了一次重大的CHIKV疫情（86），因此假定患者1、3、4和5也在此期间受到感染。人类患者性别（如已知）：CHIKV/IAV双阴性对照血清（男性，m）；IAV控制血浆（未知）；DC2（母，f）；PC1 (f);PC2 (m);生物(m);PC4 (m);PC5 (m);电脑(6)。在任何实验中使用前，人血清和血浆样品在56°C下热灭活30分钟。
细胞 实验用细胞系 非洲绿猴Vero细胞；Kartik Chandran博士，Einstein, Bronx， NY的馈赠)在DMEM （Cytiva, Marlborough， MA）中培养，该DMEM由高葡萄糖（4.5 g/L）、L-谷氨酰胺（4mm）和丙酮酸钠（1mm）配制，另外添加胎牛血清(10%,vol/vol；GeminiBio, West Sacramento， CA)和Pen-Strep(100单位青霉素/mL和100μg链霉素/mL；吉布科，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。人骨肉瘤U-2 OS细胞（ATCC, Manassas， VA）在McCoy 's 5A（改良）培养基中培养，外加添加FBS （10%, vol/vol）和penp - strep。
用于制造病毒的细胞系 幼鼠肾BHK-21细胞克隆WI-2是Ari Helenius博士赠送的，BHK-21克隆C-13是从ATCC购买的。两株BHK-21细胞系均在高糖（4.5 g/L）和L-谷氨酰胺（4 mM）配制的DMEM （Cytiva）中培养，并添加FBS (5%, vol/vol: WI-2；10%, vol/vol: C-13), Tryptose Phosphate Broth (10%, vol/vol；Gibco)和Pen-Strep。
除非另有说明，所有细胞在37°C和5% CO条件下生长和感染 2 。使用MycoScope PCR支原体检测试剂盒（Genlantis/Amsbio Cambridge， MA）常规检查细胞系是否受支原体污染。
病毒RNA和病毒库的生产 甲病毒感染性克隆 利用野生型pSP6-SFV4感染克隆[SFV WT(87)]产生突变体SFV E2 T12I（65）、SFV E2 R250G（66, 88）和SFV Cp MXI（35, 89）。CHIKV疫苗株感染克隆pSinRep5-181/25ic [CHIKV 181/25(77)]是Terence Dermody博士赠送的，用于生成CHIKV 181/25 E1 F95A（90）和CHIKV 181/25 E2 K200A（79, 80）。表达GFP的报告病毒CHIKV 181/25 GFP（91）是Elena Frolova博士赠送的礼物。
如前所述，使用传染性克隆来生成病毒库( 28， 45）. 简而言之，传染性克隆质粒 在体外 使用SP6 RNA聚合酶转录（Promega, Madison， WI）。得到的感染性病毒RNA要么使用RNeasy MiniElute Kit （Qiagen, Germantown， MD）纯化，如果用于正向转染，则保存在- 80°C，要么直接电穿孔到BHK-21细胞中用于生产病毒储存。为了获得最佳的病毒滴度，在BHK-21/C-13细胞中产生野生型和突变型CHIKV砧木，在BHK-21/WI-2细胞中产生野生型和突变型SFV砧木( 92）. 电穿孔24 h后收集细胞培养基，离心澄清(10000 × g ， 4℃，10 min)。澄清后的上清液用10 mM HEPES pH 8.0缓冲，并在- 80°C冷冻。冷冻病毒库解冻，并按下文描述的方法用聚焦形成试验进行滴度测定。
用焦点形成法测定病毒 Vero或U-2 OS细胞在96孔板的完整培养基中培养20 h，然后切换到150μL [MEM中添加0.2%,wt/vol，牛血清白蛋白（BSA）， penp - strep和10 mM HEPES pH 7.0]，并加入50μL 10倍稀释的病毒原液接种。37℃，5% CO孵育1小时后 2 )，接种物替换为150μL覆盖层，覆盖层由[2%羧甲基纤维素汉克斯盐溶液]和[MEM +热灭活胎牛血清（4%,vol/vol）， 2X penp - strep， L-谷氨酰胺(4 mM；Gibco)和20 mM HEPES （pH 7.0）。在37°C （CHIKV）或28°C （SFV）条件下培养病灶14-16小时。样品用多聚甲醛（PFA）固定；1%， vol/vol在PBS中；电镜科学，Hatfield， PA)，用37°C预热的PBS广泛洗涤，并用渗透性洗涤缓冲液[PBS加BSA （0.1%, wt/vol）和皂苷（0.1%,wt/vol）]在室温（RT）下阻断15分钟。用anti-E2 mAb （E2-1）在RT下免疫标记2小时；澄清杂交瘤上清( 64)在渗透性洗涤缓冲液中稀释1:10。用PBS洗涤样品，用50μL酶标二抗[过氧化物酶标记的抗小鼠IgG (h + L)]在RT下孵育1小时；Seracare No: 5450-0011, Milford， MA]在渗透性洗涤缓冲液中稀释1:10 00，用PBS洗涤，用50μL Kpl TrueBlue过氧化物酶底物（Seracare）在RT下孵育25分钟形成病灶。用MilliQ超纯水广泛洗涤板以停止过氧化物酶反应。平板在室温下风干，使用带有Biospot 7.0.9.10软件的ImmunoSpot S6 Macroanalyzer （Cellular Technologies, Shaker Heights， OH）进行聚焦定量。
pSFV和pCHIKV构建体的生成 通过PCR将病毒ORF亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(?)（Invitrogen）中，生成表达SFV或CHIKV结构蛋白的质粒（pSFV和pCHIKV）。对于pSFV构建体，包括Kozak序列（5 ' -GCCACCATG-3 '），并使用以下序列作为模板：pSP6-SFV4 ( 45)、pSP6-SFV4/mutL ( 41)、pSP6-SFV4/Y399R ( 18)，或pSFV-SFV4/Δ6K/TF ( 45)使用正向引物：5 ' - CATGGATCCGCCACCATGAATTACATCCC -3 ‘，反向引物：5 ’ - CATTAAGCTTTTATCTGCGGAGCCCA ATGC-3”。从pSP6-SFV4中亚克隆结构蛋白ORF，删除完整的E1编码序列，通过PCR增加一个3 ‘停止密码子（反向引物：5 ’ -），生成pSFV ΔE1表达载体 ACTTAAGCTTTTAAGCTCTGGCGGTTGCCCCGAG 3 ')。对于pCHIKV表达构建体，包括Kozak序列（5 ' -NCCGCCACCATGG-3 '），并使用以下CHIKV感染克隆作为模板：CHIKV 181/25 ( 93) (Terence Dermody博士赠予，GenBank加入 L37661.3）; CHIKV 37997ic ( 94(来自特伦斯·德莫迪博士的善意礼物；加入基因库 AY726732.1）; Chikv af15561 ( 77(来自特伦斯·德莫迪博士的善意礼物；加入基因库 EF452493.1）; 及CHIKV larsamununion 2006 OPY-1 06-049 ( 95)(由dr。萨默里斯·库德克和马尔科·维格努齐；加入基因库 AM258994.1）. pCHIKV S27构建体的结构蛋白ORF通过两个人类密码子优化片段的GIBSON组装插入到pcDNA3.1（?）骨架中，使用的是S27非洲原型菌株序列（Uniprot登录q8朱5）；E3-E2-6K-E1序列是Kartik Chandran博士( 51）; Cp编码序列由Integrated DNA Technologies （San Diego， CA）合成。Western blot分析验证了pCHIKV结构蛋白的表达和VLP的产生。所有序列均通过完整ORF测序（Genewiz, South Plainfield， NJ）进行验证。
ILE形成 Vero或U-2 OS细胞在各自的细胞培养基中接种于μ-Slide 8 Well Glass Bottom成像载玻片（Ibidi, Gr?felfing，德国），培养24小时。为了进行感染分析，细胞分别在分别添加0.2% BSA和10 mM HEPES pH 7.0的细胞基础培养基中接种SFV或CHIKV 181/25 GFP 1小时，然后在各自的细胞完全培养基中孵育8 hpi （SFV）或11 hpi （CHIKV）。注意细胞系的选择：传染性CHIKV的实验是在人类细胞系U-2 OS中进行的，因为这些细胞很容易被感染，形成ILEs，并且最适合共聚焦成像。由于SFV在U-2 OS中的感染不会诱导ILE的形成，因此在Vero（猴子）细胞中进行了传染性SFV的实验，Vero（猴子）细胞容易被感染、成像并产生ILEs。或者，按照制造商的说明，用600 ng指定的CHIKV病毒RNA和0.6μL脂质体2000 （Invitrogen, Waltham， MA， USA）向前转染Vero细胞。简而言之，脂质体和病毒RNA分别用75μL的Opti-MEM （Gibco）稀释，在RT下孵育5分钟，混合后再孵育30分钟。细胞用无rnase的PBS （Gibco）洗涤一次，用150μL的转染混合物孵育2小时。然后将培养基换成完整的生长培养基，孵育持续到11 hpi。为了检测蛋白表达，如上所述，用500 ng质粒和0.75μL脂质体2000前转染Vero或U-2 OS细胞。用150μL转染混合物孵育5小时后，将培养基换成完整的生长培养基，继续孵育19小时。孵育期结束后，用PFA固定所有细胞样本，并按如下所述进行共聚焦显微镜处理。
抗体对ILE形成的影响 接种于μ-Slide 8孔玻璃底成像载玻片（Ibidi）上的U-2 OS细胞用上述CHIKV 181/25 GFP感染。在2 hpi时，将培养基换成300μL不含Ab（无Ab对照）的完整Vero生长培养基；或20μg/mL指定的单抗、Fab或scFv到CHIKV E1或E2，或1:100或1:10 000稀释的热灭活人血清或血浆。细胞再孵育9小时，用PFA在11 hpi下固定，如下所述进行显微镜处理。
抗chikv抗体和片段 除非另有说明，以下抗体为单克隆抗体，并识别指定的CHIKV病毒表位(另见 表S1）. E10-18（抗e1）、K9-1（抗e2）和D3-62（抗e2）是从免疫了CHIKV La r<s:1> 2006临床分离株05-115的p62-E1异源二聚体小鼠的杂杂瘤上清中纯化出来的。 33)，并由dr。他们是库德克和勒克特。相应的K9-1和D3-62抗原结合片段（Fabs）以及E10-18单链可变片段（scFv）稳定表达 黑腹果蝇 施耐德2细胞系，使用StrepTactin柱亲和层析纯化，由f<s:1> lix Rey博士提供。chCHK-166（抗e1）、ch-m242（抗e2）、chCHK-265（抗e2）和chCHK-152（抗e2）通过在自由式293F细胞中从pMAZ-IgL和pMAZ-IgH质粒中瞬时表达各自的可变结构域序列和人类恒定结构域，在人恒定结构域上嵌合，然后按照前面描述的方法进行蛋白a层析纯化（Thermo Fisher Scientific, Wlatham， MA） ( 51， 96）. 同样，C9也是如此 pMAZ Ab序列( 52)由Integrated DNA Technologies （San Diego， CA）合成，插入pMAZ-IgL和pMAZ-IgH-KRRG，在人恒定结构域主干上进行重组表达( 51）. 制备过程 pMAZ Ab在ExpiCHO-S细胞中表达( 97)，并通过标准蛋白A层析纯化（Thermo Fisher Scientific, Wlatham， MA）。单克隆抗体DC2.112（抗e1）和DC2。M108（抗e2）先前从一名康复期的CHIKV病人( 51， 57）. 单克隆抗体chCHK-116、ch-m242、chCHK-265、DC2.112、DC2。M108由黎医生( 48， 49， 51， 54 - - - - - - 58， 70)， chCHK-152由Zachary Bornholdt博士（Mapp biopharmactical）提供。在杂交瘤细胞中制备黄病毒E蛋白的单抗DEN-4G2，从细胞上清中纯化( 98）.
细胞表面ELISA 使用细胞表面ELISA定量测定了CHIKV单克隆抗体与先前描述的方案改编的感染细胞表面的结合( 33）. 简单地说，用CHIKV 181/25 GFP （moi5）在37℃下感染96孔板上的U-2 OS细胞2 h。在11 hpi时，用不透性的PFA固定细胞，用单抗连续稀释孵育（1小时，RT），用hrp偶联的山羊抗小鼠（1:10 00,SeraCare, 5450-0011）或山羊抗人IgG （1:10 00, SeraCare, 5450-0009）检测单抗的初代结合，使用Ultra-TMB比色底物（Thermo Fisher #34028）。比色反应用2N H猝灭 2 所以 4 在VictorX5 Multilabel平板阅读器（PerkinElmer, Shelton， CT）上测量450nm处的吸光度。
免疫荧光染色和显微镜 样品用37°C PBS洗涤，然后用1% PFA在PBS中RT固定20分钟。除非另有说明，以下孵育步骤在黑暗中进行。细胞清洗后用透性阻断（PB）缓冲液（含5% BSA和0.2% Triton X-100的PBS）在室温下阻断3 × 5分钟。用稀释在PB缓冲液中的原代抗体在4°C下孵育过夜。SFV或chikv感染的细胞用兔抗p62/E2-E1血清（1:800）或小鼠单克隆抗e2抗体20.2.9（杂交瘤上清，1:50）标记( 64） （ 表1）. 用小鼠或兔单克隆抗β-微管蛋白Ab标记微管(小鼠：E7, 1:400；美国爱荷华州爱荷华市DSHB；兔子：9F3 #2128, 1:50；细胞信号技术，贝弗利，马萨诸塞州 表1）. 用PB缓冲液在室温下冲洗3 × 5 min，然后用次级抗体和Hoechst 33342 （1:50 000, Invitrogen, Waltham， MA）在室温下孵育2.5 h，用PB缓冲液稀释。请参考 表1用于所使用的一抗和二抗的组合。再用PB缓冲液在RT下冲洗3 × 5分钟，PBS成像。所有样本除了 图4 f在尼康旋转CSU-W1旋转盘共聚焦显微镜（尼康，梅尔维尔，NY）上成像，60倍油物镜，获得 z -stack with Δ z = 0.3μm和最小的总量 z -体积为3μm。由于仪器的可用性，样品在 图4 f使用DeltaVision Core倒置奥林巴斯IX71显微镜（Olympus, Waltham， MA）， 60倍油物镜，获得 z -stack with Δ z = 0.4μm和最小的总量 z -体积4.4μm。显微镜设置如激光功率、曝光时间和扫描速度在实验之间保持不变。
表1 免疫荧光显微镜中使用的一抗和二抗 e图面板 初级抗vp Ab（检测） 初级抗vp（实验）一个 初级防浴盆Ab 二级抗体（抗IgG H + L）c 图1B、E、3A、F、6A；图S2A和S4A 抗p62/E2-E1血清（p, rb） 厦门市。 抗β-桶（m, ms） VP: gt anti-rb AF568 （A11011） 图7A、B；图S5A 抗p62/E2-E1血清（p, rb） 抗chikv血清（p, hu） 抗β-桶（m, ms） VP: gt anti - rb AF640 （A21244） 图2D和4D 抗p62/E2-E1血清（p, rb） chCHK152, chCHK265, ch-m242, chCHK166 (m，嵌合b）pMAZ , DC2。M108, DC2.112 （m, hu） 抗β-桶（m, ms） VP: gt anti - rb AF640 （A21244） 图2D和4D 抗e2 （IgG2a, m, ms） IgG1 （anti-E2, mono, ms） Anti-β-tub （m, rb） VP：抗ms AF640 （A31571）d 图5 抗e2 （IgG2a, m, ms） K9-1, D3-62 Fab（抗e2， m, ms）d Anti-β-tub （m, rb） VP：抗ms AF640 （A31571）
a 如上文“抗体对ILE形成的影响”所述，实验抗体浓度为20μg/mL，来源如上文“抗chikv抗体和片段”所述。
b
c
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ILE定量 使用Fiji软件( 99)，如果满足以下条件（定义为），则对ILE进行评分。 32， 33)：延伸(i)来自受感染细胞，（ii）接触目标细胞，（iii）微管蛋白阳性，（iv）长度大于10μm。分支ILE被视为单个ILE；具有与自身细胞体接触延伸的细胞（即产生ILE的细胞也是靶细胞）被排除在分析之外。为了解释ILEs的三维性质，它们在a中的不同平面上被追踪 z 如果需要-stack。微管蛋白的共定位和延伸是在单片图像而不是在 z 预测。每种情况下，最少94个，最多374个个体感染细胞被分析（累积跨越三个生物重复）。
流式细胞术分析表面和总E2水平 用pSFV WT或pSFV ΔE1质粒（5μg）和脂质体2000（5μL）正向转染六个孔板（Corning, Corning， NY）中的Vero细胞；Invitrogen)，按照制造商的说明。短暂,lipofectamine和质粒DNA都分别稀释500μL Opti-MEM (Gibco),孵化的RT 5分钟,混合,和孵化一个额外的30分钟。细胞1毫升转染混合孵育5 h,维罗生长介质和介质交换的完成和孵化持续了一个额外的19 h。细胞被洗一次37°C PBS和脱离板与Accutase 37°C 3分钟(微孔σ,伯灵顿,妈,美国)。所有后续步骤均在冰上或在4°C下使用冰冷的溶液和试剂进行。除非另有说明，否则用流式细胞术（FC）缓冲液（PBS含2% BSA和15 mM HEPES pH 7.0）洗涤样品。将样品转移到1.5 mL的试管中，先用Vero培养基，然后用FC缓冲液离心（600 rcf, 5 min, 4°C）洗涤。接下来，每个样品被分成渗透和非渗透样品。将经渗透的样品在含2% PFA的PBS中重悬固定30分钟，洗涤2次，用含0.2% TWEEN-20的FC缓冲液处理20分钟后再次洗涤。用mAb E2-1染色检测SFV E2，用FC缓冲液1:2稀释的杂交瘤清液，每个样品100μL，旋转1小时)。样品洗涤三次，用抗小鼠AlexaFluor 647二级Ab（1:500稀释FC缓冲液，每个样品100μL，旋转30分钟）染色；英杰公司)。然后将染色的细胞洗涤三次，如上所述再次固定，洗涤一次，然后在500μL FC缓冲液中重悬。未渗透样品平行染色，遵循与渗透样品相同的方案，但省略了第一个固定和渗透步骤。所有样本均使用LSR II型细胞仪（BD Biosciences, Franklin Lakes， NJ）进行分析，每种条件下获得15,000个细胞。使用FlowJo软件10.2版本（BD Biosciences）进一步分析样品，使用正向和侧向散射对(i)活细胞进行门控，（ii）单线态细胞，（iii）基于AF647信号强度的E2表达细胞。
统计数据 使用Prism软件10.1.0版本（GraphPad, Boston， MA）计算样本统计量，如平均值、标准差和显著性。显著性由非参数、未配对、双尾学生确定 t -测试，使用至少三次生物重复的方法。如果 P < 0.05。在数据中， P 数值四舍五入到小数点后三位。除非另有说明，所有数据均以平均值±标准差表示。
