解旋酶辅助连续编辑 对内源基因组的可编程突变

Chen等人提出了一种新的远程诱变工具，可以针对任何基因组位点连续诱变。新工具允许研究人员直接在活的人类细胞中研究基因突变

　　

基因突变的后果有好有坏——从对糖尿病等疾病的抵抗力，到对某些癌症的易感性。基因组学的一个基本挑战是了解和绘制人类基因组中30亿个碱基对蛋白质功能和基因调控的影响。因此，需要开发一种能够高通量、靶向、系统连续地诱变基因组序列的策略。特别是，单个基因组位点的靶向诱变可以模拟自然进化过程，揭示序列结构关系，功能获得和功能丧失表型以及合作突变。

基本原理

哈佛大学的研究人员开发了一种工具来对哺乳动物内源性基因组的目标区域进行靶向诱变——能够快速地在特定的感兴趣的基因中产生突变，而不会干扰基因组的其余部分。在自然界中解旋酶是一种可以穿越大的基因组区域的酶。一些解旋酶，包括那些参与DNA损伤修复的酶，可以在基因组的单链DNA区域加载并开始解旋DNA。他们推断，当这些解旋酶与脱氨酶融合时可以用于远程靶向诱变。通过单导RNA （sgRNA）和Cas9缺口酶可按照设计靶向特定基因组区域。招募的解旋酶的定向和远程DNA解绕事件将在该区域产生随机突变。

结果

他们设计了一个名为解旋酶辅助连续编辑（HACE）的平台，该平台将整个位点的远程编辑与CRISPR基因编辑工具固有的序列可按设计性相结合。HACE使用CRISPR-Cas9来指导装载解旋酶-脱氨酶融合，以实现下游基因组序列的靶向超突变。HACE可实现超过1000个核苷酸的位点特异性脱氨，突变随着时间的推移不断积累。他们进一步评估了包含多种解旋酶、Cas9变体和脱氨酶的HACE原型，表明它们具有可调的编辑速率和范围。文章还表明，HACE可以通过最少数量的引导RNA、多路复用以靶向多个基因组区域。然后，作者将HACE应用于编码和非编码基因组背景，从功能上剖析内源性突变，这些突变赋予了耐药性、酶活性的变化和顺式调控元件功能的改变。

为了证明该工具在实验室中的作用，科学家们用它来识别一种导致丝裂原活化蛋白激酶1（MEK1）抑制剂耐药的基因突变，这种基因是癌症治疗靶点，但经常因为患病细胞的耐药性机制发生了突变而失败。利用HACE，研究小组仅对那些突变基因进行了测序，并确定了与曲美替尼和塞鲁美替尼等抗癌药物耐药性相关的几种独特变化，从而为突变如何影响药物性能提供了见解。

他们还研究了SF3B1（一种剪接因子）的突变是如何影响RNA组装的。SF3B1是一种参与RNA剪接的生物分子过程的基因。这种基因的突变在血癌中很常见，但目前尚不清楚是哪种突变导致了剪接缺陷；有了HACE，研究小组可以很容易地识别这些变异导致替代3 '剪接位点的使用。

研究人员还与哈佛医学院的布拉德利·伯恩斯坦实验室和丹娜-法伯癌症研究所合作，使用该工具更好地了解调控DNA区域的变化如何影响免疫细胞中一种蛋白质的产生，这种蛋白质被认为是癌症免疫疗法的潜在目标。他们定义了CD69增强子区域的功能性人工变异，并确定了介导RUNX转录因子对CD69调控影响的特定碱基和基序。HACE解决了传统碱基编辑筛选面临的两个限制：sgRNA识别序列中需要NGG原间隔邻近基序，以及可能产生人为联系和混淆筛选结果的旁观者突变的发生。HACE的长编辑范围也可以揭示基因座上多个远距离突变之间的组合效应和相互作用。

结论

HACE使内源性哺乳动物基因组的连续、远程、可编程多样化成为可能。我们设想HACE将大大扩展功能基因组工具箱，并使编码和非编码基因组的系统序列-功能图谱的建立成为可能。此外，HACE可以发展成为内源性基因组的定向进化系统，从而在哺乳动物生物学中选择所需功能的序列。

作者说

“HACE结合了CRISPR的精确性和编辑长段DNA的能力，使其成为靶向进化的强大工具，”资深作者、布罗德研究所干细胞和再生生物学助理教授Fei Chen解释说。

Bernstein说，有一天，像HACE这样的工具可以允许对基因调控序列进行大规模编辑，然后与深度学习计算相结合进行解码。伯恩斯坦说：“人们可以想象许多新的治疗机会，包括精确编辑或调整这些调节序列，以‘修复’基因活性并改善疾病。”