PNAS|武汉大学药学院张郑宇课题组与合作者揭示吡咯并吲哚类天然产物生物合成关键P450过氧化物酶的结构与机制

　　

近日，国际权威期刊《Proceedings of the National Academy of Sciences》在线发表了武汉大学药学院张郑宇课题组和上海交通大学瞿旭东课题组、厦门大学王斌举课题组的合作成果，题为“A nucleobase-driven P450 peroxidase system enables regio- and stereo-specific formation of C?C and C?N bonds”。本文的共同第一作者为博士后魏广证、博士生段博瑞和博士生周太平；共同通讯作者包括瞿旭东教授、张郑宇副教授和王斌举教授，文章第一单位为武汉大学药学院。

吡咯并吲哚是一大类重要的天然产物，不同的取代基、立体选择性和区域选择性，构成了此类天然产物骨架的多样性，从而也保障了这类化合物广泛的生物活性，如抗菌，抗肿瘤，抗疟原虫和抑制胆碱酯酶等。部分重要成员已被广泛地应用于临床，如治疗青光眼和胃动力障碍。该类天然产物广泛的生物活性极其引人注目，然而，由于其分子结构复杂，化学反应步骤繁多，使得构建和拓展分子骨架十分困难，大大制约了这类化合物的药学和生物学功能的研究和利用。

在前期研究中，瞿旭东课题组发现了首个能催化含色氨酸二酮哌嗪（TDKP，图1B）二聚化形成吡咯并吲哚生物碱的P450酶（Nat Commun 2018, 9, 4428），并阐明了其独特的催化机制（Nat Commun 2020, 11, 6251），从而大幅度拓展了此类P450酶的底物谱，实现了上百个活性吡咯并吲哚生物碱的生物合成（Angew Chem Int Ed 2023, 62, e202304994），并提出了此类生物碱的新分类方法（Nat Prod Rep, 2022, 39, 1721）。在本研究中，研究团队采用进化关系导向的基因组挖掘策略，从细菌中鉴定出一种新的P450酶（PtmB）。该酶能够催化三种天然的嘌呤核碱基（鸟嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤）与TDKP发生异源二聚化反应，生成独特的C3-核碱基吡咯并吲哚及核碱基-TDKP二聚体生物碱。与依赖于NAD(P)H辅因子及电子转移系统的典型TDKP二聚化P450合成酶不同，PtmB及其同源蛋白能够利用H?O?催化腺嘌呤及其他带有6-氨基的嘌呤核碱基与TDKP反应，展现出罕见的过氧化物酶活性。

张郑宇课题组通过对PtmB开展系统的结构研究，获得了多个PtmB-底物复合物的晶体结构。通过分析PtmB与腺嘌呤和TDKP复合物结构中活性中心酸碱残基、酸醇对残基以及底物腺嘌呤构象，结合定点突变分析以及结构对比，提出腺嘌呤在反应过程中可能起到激活过氧化氢的作用。后续根据结构模型提出的潜在机制通过QM/MM计算，研究团队深入揭示了PtmB独特的催化机制，发现腺嘌呤在PtmB过氧化物酶活性中的独特双重功能：既作为反应的底物，又作为酸碱催化剂激活H?O?转化为催化中间体Cpd I。进一步的底物类似物活性测试、定点突变以及分子动力学模拟结果表明，腺嘌呤6位上的NH?取代基通过参与广泛的氢键网络（图1D），对形成有利于H?O?活化的核碱基构象至关重要。分子动力学模拟还表明，环二肽TDKP具有灵活的构象转变，这进一步促进了C-C和C-N键形成吡咯并吲哚结构的立体和区位选择性合成。

该项研究建立了P450酶偶联核碱基与TDKP的结构模型，为PtmB的催化机制与核碱基取代的吡咯并吲哚类化合物的生物合成提供了分子结构方面的见解。研究鉴定出了新型吡咯并吲哚分子，丰富了该类天然产物的结构数量，为后续该类化合物的药学和生物学应用奠定基础。同时本研究创新性地发现了核碱基在P450过氧化物酶催化中作为酸碱催化剂的新功能，这一发现有望为新型P450过氧化物酶及基于核碱基的生物催化剂的开发奠定重要基础。

该研究工作得到了国家自然科学基金面上项目、青年项目以及博士后面上基金的支持。

图 1. P450-H₂O₂活性及其机制。（A）典型的 P450 过加氧酶和过氧化物酶的活性比较。（B）P450 过加氧酶和过氧化物酶中活化H₂O₂的酸碱催化机制。（C）一些代表性的TDKP二聚体及TDKP核碱基二聚体天然产物。（D）本研究发现的核碱基催化机制。

 

论文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2412890121