抗体不起作用！让实验室摆脱破坏实验的分子的竞赛

几十年来，表现不佳的抗体一直困扰着生物医学科学。一些新的倡议希望改变这种状况。

　　

Nature

Carl Laflamme知道他想研究哪种蛋白质，但不知道在哪里找到它。它是由一种名为C9ORF72的基因编码的，这种基因在一些患有破坏性神经系统疾病运动神经元疾病（也称为肌萎缩性侧索硬化症）的人身上发生了突变。Laflamme想了解它在疾病中的作用。

当他开始在加拿大蒙特利尔神经学研究所医院做博士后研究时，Laflamme查阅了文献，寻找有关这种蛋白质的信息。问题是，似乎没有一篇论文对这种神秘分子在细胞中的作用达成一致。“这个领域有太多的困惑，”Laflamme说。

他想知道这是否应该归咎于一种试剂，尤其是科学家用来测量蛋白质含量并追踪其在细胞中的位置的抗体。因此，他和他的同事决定测试可用的抗体。他们确定了16种商业抗体，这些抗体被宣传为能够与C9ORF72编码的蛋白质结合。当研究人员对它们进行测试时，只有三个表现良好——这意味着抗体与目标蛋白质结合而不与其他分子结合。但没有一项已发表的研究使用了这些抗体。大约有15篇论文描述了使用一种抗体的实验，这种抗体甚至没有结合Laflamme测试中的关键蛋白质。这些论文总共被引用了3000多次。

Laflamme的经历并不罕见。科学家们早就知道，许多商业抗体并不像它们应该的那样起作用——它们经常不能识别特定的蛋白质，或者非选择性地与其他几个目标结合。结果是时间和资源的浪费，有人说这导致了生物科学的“可重复性危机”，可能会减缓发现和药物开发的步伐。

Laflamme是希望解决研究中不可靠抗体问题的一个不断壮大的团体的一部分。他与加拿大多伦多大学的分子遗传学家Aled Edwards合作，通过开放科学（YCharOS，发音为“伊卡洛斯”）建立了抗体表征，这是一项旨在表征每种人类蛋白质的商业研究抗体的倡议。

目前也在努力生产性能更好的抗体，使研究人员更容易找到它们，并鼓励研究界在选择和使用这些分子时采用最佳做法。英国莱斯特大学的内科科学家Harvinder Virk说，抗体供应商、资助机构和科学出版商都加入了这一行动。“很难想象一个持续了这么久的问题会突然改变——但我对此充满希望。”

对抗体进行测试

免疫系统会产生抗体来应对外来物质，如病毒和细菌，并标记它们以进行破坏。这使得抗体在实验室实验中很有用。科学家们利用这种能力来标记或量化特定的生物分子，比如蛋白质的一个片段。为了有效，这些分子标签需要同时具有特异性（对靶标有很强的亲和力）和选择性（使其他蛋白质不被标记的能力）。

几十年来，科学家们自己制造了这些抗体。他们将蛋白质注射到动物体内，比如兔子，兔子的免疫系统会产生针对外来分子的抗体。为了创造更长期、更稳定的抗体供应，研究人员从动物身上提取免疫细胞，并将它们与永生的癌细胞结合起来。当试剂公司在20世纪90年代开始大规模生产抗体时，大多数研究人员转向从目录中购买抗体。如今，市场上约有770万种研究用抗体产品，由全球近350家抗体供应商销售。

在2000年代末，科学家们开始报告许多市售抗体的特异性和选择性存在问题，导致研究人员呼吁成立一个独立的机构来证明这些分子像宣传的那样起作用。多年来，一些团体已经开始努力评估抗体。

使YCharOS与众不同的是它从抗体销售公司获得的合作水平。当Laflamme和Edwards开始创建YCharOS时，他们给他们能找到的每个供应商都打了电话；有十几家公司对合作感兴趣。YCharOS的行业合作伙伴免费提供用于测试的抗体。合作伙伴，以及计划的资助者（包括各种非营利组织和资助机构），都有机会在特征报告发布之前审查并提供反馈。

YCharOS通过比较它们在正常生物学水平表达目标蛋白的细胞系中的特异性和它们在缺乏该蛋白的敲除细胞系中的表现来测试抗体。

在去年发表在《eLife》上的一篇分析文章中，YCharOS团队使用这种方法评估了614种商业抗体，总共针对65种神经科学相关蛋白。其中三分之二没有达到制造商推荐的效果。

YCharOS的运营总监Riham Ayoubi说：“抗体的成功与否总是让我感到惊讶。“这表明在工作中加入消极控制是多么重要。”

抗体制造商重新评估了YCharOS在2023年标记的一半以上表现不佳的抗体。他们对其中的153种产品发布了最新建议，并将73种产品从市场上撤下。YCharOS团队目前已经测试了1000多种抗体，这些抗体将与100多种人类蛋白质结合。

“前面还有很多工作要做，”Laflamme说。他估计，在160万种商业上可用的人类蛋白质抗体中，大约有20万种是独特的（许多供应商以不同的名称销售相同的抗体）。

斯德哥尔摩KTH皇家理工学院的癌症研究员Cecilia Williams说：“我认为YCharOS计划真的能带来改变。”她说：“但这并不是全部，因为研究人员会在其他方案中使用这些抗体，在其他可能以不同方式表达蛋白质的组织和细胞中使用这些抗体。”抗体使用的环境可以改变它们的表现。

其他的表征工作也在试图解决这一挑战。Andrea Radtke和她的合作者是一个叫做人类生物分子图谱计划的细胞测绘联盟的成员，他们建立了器官测绘抗体小组（OMAPs）。omap是社区验证抗体的集合，用于多重成像——一种在单个标本中可视化几种蛋白质的技术。与YCharOS不同的是，YCharOS专注于在一个特定的环境中对各种应用的抗体进行严格的表征，OMAPs正在研究抗体的单一应用，但在不同的环境中，如不同的人体组织和成像方法。为此，OMAPs从学术界和工业界招募科学家，在他们自己的实验室进行验证。

“供应商不能测试他们抗体的所有可能的应用，但作为一个社区，我们可以说‘让我们试试这个’，”Radtke说，他现在是马里兰州贝塞斯达徕卡微系统仪器公司的首席科学家。“人们正在测试一些你认为自己永远无法测试的东西。”

扩展工具箱

即使有好的抗体，它们也不总是那么容易找到。2009年，加州圣地亚哥数据共享平台SciCrunch的创始人兼首席执行官Anita Bandrowski和她的同事们研究了在期刊文章中识别抗体的难度。在筛选了《神经科学杂志》上的论文后，他们发现90%的抗体缺乏目录号（供应商用来标记特定产品的代码），这使得它们几乎不可能被追踪到。Bandrowski说，要重复一个实验，重要的是要有正确的试剂，而正确的标记对于找到它们至关重要。

在看到类似的问题困扰着其他期刊之后，Bandrowski和她的同事们决定为抗体和其他科学资源（如模式生物）创建独特的、持久的标识符，他们称之为研究资源标识符（rrid）。如果一家公司停止生产一种产品，目录号可能会消失，而且由于公司是独立创建目录号的，两种不同的产品最终可能会使用相同的目录号。rid解决了这个问题。

2014年，Bandrowski和她的团队在25家期刊上启动了一个试点项目，他们要求作者在他们的手稿中加入rrid。从那以后的几年里，有1000多家期刊采用了要求这些标识符的政策。Bandrowski说：“我们目前有近100万篇论文被引用到rrid。”

Bandrowski说，最终，希望是每篇期刊文章的作者都能清楚地用rrid标记他们使用的资源，比如抗体。“这本身不会改变可重复性，但这是第一步。”

除了能够追踪抗体外，研究人员还需要一种方法来选择使用哪种抗体。2012年，当时还是英国巴斯大学研究员的Andrew Chalmers与人共同创立了CiteAb，这是一个帮助研究人员找到被引用率最高的抗体的搜索引擎。多年来，该平台已经发展到包括700多万种抗体，现在还包括有关验证的信息。今年5月，CiteAb开始将YCharOS的特征数据整合到自己的网站上。

他说：“最大的挑战是，抗体被用于如此多不同的方式，针对如此多不同的物种，你无法确定抗体是好是坏。”许多人说，敲除验证是关键，但CiteAb中只有不到5%的抗体通过供应商或其他独立项目（如YCharOS）以这种方式进行了验证。“还有很长的路要走。”

利益相关者参与

和其他许多人一样，在经历了不良抗体之后，Virk对抗体的可靠性产生了兴趣。2016年，Virk获得了一笔巨额拨款，用于研究一种名为TRPA1的蛋白质在气道炎症中的作用。但他的一位同事提到，根据他自己的经验，他正在研究的抗体可能不可靠。

当Virk对TRPA1抗体进行测试时，他发现他的同事是对的：在用于研究TRPA1的三种被引用最多的抗体中，有两种根本没有检测到人类蛋白质，另一种同时检测到其他几种蛋白质。“这让我很震惊，”Virk说。“在那个时候，我想离开科学——因为如果事情真的如此不可靠，那还有什么意义？”

Virk没有离开学术界，而是在去年共同创立了Only Good Antibodies （OGA）社区，其目的是将利益相关者——例如研究人员、抗体制造商、资助机构和出版商——聚集在一起，解决性能不佳的抗体问题。今年2月，OGA社区举办了第一次研讨会，来自这些不同团体的个人参加了研讨会，讨论如何提高用抗体进行的研究的可重复性。NC3Rs也加入了他们的行列。NC3Rs是一家总部位于伦敦的科学组织和资助者，致力于减少在研究中使用动物。更好的抗体意味着在生产这些分子和用它们进行实验的过程中使用更少的动物。

目前，OGA社区正在开展一个项目，帮助研究人员为他们的工作选择正确的抗体，并使他们更容易识别、使用和共享有关抗体质量的数据。它还在莱斯特大学试点了一个YCharOS站点——这是加拿大以外的第一个站点——它将专注于呼吸科学中使用的抗体。OGA社区还在与资助者和出版商合作，寻找奖励采用抗体相关最佳实践的研究人员的方法。此类奖励的例子包括为参与抗体验证计划的科学家提供资助。

制造商也一直在采取措施提高抗体的性能。除了越来越多地进行自己的淘汰验证外，许多供应商也在改变一些产品的制造方式。

修改抗体生产方法的必要性在2015年被提上了议事议事的位置，当时一个由100多名科学家组成的小组在《自然》杂志上发表了一篇评论，呼吁医学界从免疫细胞或免疫癌细胞杂交产生的抗体转向所谓的重组抗体。重组抗体是在基因工程细胞中产生的，这些细胞可以产生特定的抗体。作者认为，只使用这些抗体将使抗体的无限生产不随批次而变化——这是旧方法的一个关键问题。

一些制造商正在转向生产更多的重组抗体。例如，英国剑桥的抗体供应商Abcam已在其产品组合中增加了逾3.2万种抗体。Abcam公司负责新产品开发的副总裁Hannah Cable说：“促进生命科学研究向重组方向发展是提高可重复性的关键部分。”“这是抗体供应商应该做的事情。”

位于马萨诸塞州波士顿的蛋白质创新研究所（Institute for Protein Innovation）是一家生产重组抗体的非营利性研究机构，该机构的抗体平台主管Rob Meijers表示，这种转变更具有商业意义。他说：“它们更容易复制，你可以为它们标准化流程，用户反馈也非常积极。”

CiteAb的数据显示，在过去十年中，科学家在使用抗体方面的行为发生了巨大变化。从2023年开始，涉及抗体的论文中约有20%使用了重组。如今担任CiteAb首席执行官的Chalmers表示：“与十年前相比，这是一个巨大的变化。”

领导这项研究的人说，尽管正在进行的提高抗体可靠性的努力是朝着正确方向迈出的一步，但改变科学家的行为仍然是最大的挑战之一。Chalmers说，在某些情况下，研究人员不想听到他们在实验中使用的抗体实际上没有发挥其应有的作用。“如果有人对抗体的结果感到满意，即使确定它不会与这种蛋白质结合，也会不顾一切地使用它。”“你永远无法回避研究人员必须进行验证的事实”。

尽管如此，许多科学家还是希望最近的努力能带来急需的改变。Radtke说：“我对情况正在好转持乐观态度。“让我感到鼓舞的是，年轻一代的科学家们更像一群人，他们正作为一个社区共同努力解决这个问题。”