PNAS：接近血液中细胞外囊泡中的帕金森病蛋白

帕金森氏症或阿尔茨海默氏症等脑部疾病在患者身上的发病时间要比首次临床症状出现的时间早得多。在这些早期阶段治疗患者可能会减缓甚至阻止他们的疾病，但目前还没有办法在这些症状前阶段诊断大脑疾病。由哈佛大学Wyss研究所和布莱根妇女医院的David Walt领导的一个合作小组改进了他们的技术平台，用于检测细胞外囊泡中的疾病生物标志物，迈出了关键的一步，使他们离目标更近了一步。通过酶促消化来自纯化EV群体的所有表面结合蛋白，他们能够特异性地定位在EV内部pd特异性货物蛋白-synuclein上，同时消除非特异性的“污染”。

　　

接近血液中细胞外囊泡中的帕金森病蛋白

通过专门获取血液中器官来源的细胞外囊泡的内容物的新能力，对影响大脑和其他器官的疾病的精确诊断更加接近

像帕金森氏症（PD）或阿尔茨海默病（AD）这样的脑部疾病在患者身上的发展比他们最初的临床症状出现的时间要早得多。在这些早期阶段治疗患者可能会减缓甚至阻止他们的疾病，但目前还没有办法在这些症状前阶段诊断大脑疾病。例如，到目前为止，PD引起的特定脑损伤只能通过分析脑活检来检测，而脑活检只能在死后获得。

为了克服这一关键瓶颈，研究人员一直在追求“液体活检”的新概念，这涉及到使用非侵入性程序轻松提取血液或其他体液，并分析来自大脑和其他固体组织的分子。体液中一个特别有希望的目标是“细胞外囊泡”（EVs），这是一种由大脑和其他细胞释放到周围液体中的微小膜结合囊。这些囊含有多种分子，这些分子可能是产生它们的细胞类型（如大脑）所特有的，因此也可能携带帕金森病和其他脑部疾病早期发病的受保护生物标志物。

然而，尽管最近取得了进展，电动汽车专家们仍无法解决他们在分离的电动汽车中测量的特定生物标志物分子是否严格包含在电动汽车内部或非特异性结合在其表面的问题。这一挑战实际上阻碍了他们对电动汽车中来自所有类型组织的货物分子做出明确的结论。

现在，由哈佛大学威斯研究所和波士顿布里格姆妇女医院（BWH）的大卫·沃尔特博士领导的一个合作团队解决了这个问题，他们在已经验证的超敏感协议上增加了关键的一步。通过酶促消化来自纯化EV群体的所有表面结合蛋白，他们能够特异性地定位在EV内部受保护的货物上，同时消除非特异性的“污染”。使用他们的增强方案来测量血液中的PD生物标记物-突触核蛋白，他们第一次能够准确地确定EVs中含有的任何蛋白质的一小部分与总血浆中游离蛋白质的含量。

重要的是，他们将这一进展与一种新开发的超灵敏检测方法结合起来，该检测方法用于检测一种在PD和路易体痴呆相关疾病进展过程中磷酸化程度越来越高的 突触核蛋白。分析一组患者样本，他们可以检测到EVs内病理学的      突触核蛋白相对于总血浆的富集。研究结果发表在《美国科学院院刊》上。    

“在过去的几十年里，我们和其他团队对电动汽车的研究稳步推进了我们对其复杂生物学和分子组成的理解。然而，从血液或中枢神经系统（包括大脑）周围的脑脊液等体液中分离纯组织特异性ev，并通过精确测量验证和量化其真实内容，仍然存在巨大的技术挑战，”Wyss Core教员Walt说。“我们最近的工作是提供一种解决方案来帮助填补这一技术空白，并使我们更接近能够获得无污染的电动汽车，以便将它们用作临床生物标志物的丰富来源，正如我们用磷酸化的<s:1>突触核蛋白的例子所展示的那样。”沃尔特是Wyss研究所诊断加速器的教师领导，也是哈佛医学院（HMS） Hansj?rg Wyss生物启发工程教授，布里格姆妇女医院病理学教授，以及霍华德休斯医学研究所教授。

从血液到生物标志物再到诊断

特别是受到电动汽车在PD、AD和其他脑部疾病早期诊断方面的前景的推动，沃尔特集团一直在系统地为这一技术拼图填补重要的部分。在Good Ventures、陈-扎克伯格倡议（Chan Zuckerberg Initiative）以及最近的迈克尔·j·福克斯基金会（Michael J. Fox Foundation）的慈善支持下，他们此前开发了一种量化电动汽车的技术框架，并利用这种量化方法比较了从体液中分离电动汽车的方法。他们的方法结合了一种称为大小排除色谱（SEC）的分离技术，通过超灵敏的“Simoa测定法”从生物流体中回收大多数ev，这种方法允许他们对捕获的ev相关的单个蛋白质分子进行计数，并用特定抗体进行可视化。到目前为止，该团队已经设计了Simoa检测各种ev特异性生物标志物，重要的是，排除了广泛使用的候选表面蛋白L1CAM作为分离脑特异性ev的目标，这为该领域提供了重要的方向修正。

“为了回答概念上简单但技术上具有挑战性的问题，即血浆中存在的给定蛋白质（如  synuclein）相对于外部在EV内部的百分比，我们使用了我们之前开发的SEC分离方法，从血浆中分离出大多数EV，并使用优化的‘蛋白酶保护试验’，其中我们使用酶温和但有效地咀嚼分离EV表面的所有蛋白质，同时保持膜封闭EV内部完整。共同第一作者Dima Ter-Ovanesyan博士说，他是Wyss研究所的高级科学家，与共同第一作者和博士后研究员Tal Gilboa博士一起领导了EV项目。

此外，为了在非常低的水平下测量  -synuclein， Gilboa与博士后研究员Gina Wang博士和沃尔特实验室的Wyss研究助理Sara Whiteman一起，开发了一种       -synuclein的Simoa检测方法，该方法比以前报道的任何检测方法都要敏感得多。在他们的方案中使用该试验，研究小组能够确定使用他们的SEC方案分离的ev中的大部分      -synuclein受到保护，并且该量小于血浆中总       -synuclein的5%。了解这一数量对于测量神经元源性ev中的 突触核蛋白的最终目标尤为重要，因为来自特定组织（如大脑）的ev相对于来自血细胞的ev而言预计是罕见的，其中也表达了          突触核蛋白。            

重要的是，除了超灵敏的Simoa检测方法（使他们能够检测正常的未修饰的-synuclein蛋白）外，他们还开发了一种检测方法，能够检测在PD进展过程中在特定位点磷酸化的-synuclein （pSer129）。Gilboa说：“当我们将先进的方法应用于从PD和路易体痴呆患者以及健康对照供体中获得的一组血液样本时，我们发现ev内磷酸化的<s:1>突触核蛋白与总<s:1>突触核蛋白的比例比ev外高两到三倍。”“这是非常令人兴奋的，因为它表明电动汽车可以保护蛋白质的磷酸化状态免受循环磷酸酶的影响，否则这些磷酸酶会抹去这一信息丰富的标记。”该团队目前正在进一步探索这些检测是否可以用于区分PD患者和非PD患者。

“David Walt团队的工作展示了一种技术力作，使我们越来越接近具有非凡潜力的下一代诊断平台。在这一点上，我们离使用这些极其丰富和有意义的细胞来源的小囊作为不需要手术就能进入患者大脑的窗口不远了，”Wyss创始董事Donald Ingber说，他也是HMS和波士顿儿童医院的Judah Folkman血管生物学教授和哈佛大学John a . Paulson工程和应用科学学院的Hansj?rg Wyss生物启发工程教授。

该论文的其他作者是George Church博士，他是HMS的Wyss Core教员和Robert Winthrop遗传学教授，Alice Chen-Plotkin医学博士，他是费城宾夕法尼亚大学Perelman医学院的Parker家族神经学教授，他们从EV项目开始就与Walt的团队合作，还有George Kannarkat。这项工作得到了Michael J. Fox基金会（Grant #2021A017224）、Chan Zuckerberg Initiative NeuroDegeneration Challenge Network和Good Ventures的资助。吉尔博是魏茨曼科学研究所女性博士后职业发展奖的获得者。