Nature Methods：更小的基因组编辑核酸酶

在过去的十年里，科学家们几乎完全依赖CRISPR-Cas系统进行基因组编辑。现在，一个更小但同样有效的核酸酶在这里竞争。

　　

当厨师开发出一种新食谱时，他们会有条不紊地添加和删除各种食材，看看每一种食材如何改变最终的菜肴。当科学家试图了解基因在体内的作用时，他们采用了类似的策略，即基因组编辑。目前，他们工具箱中最流行的工具是CRISPR，其应用范围从癌症治疗到镰状细胞性贫血和β-地中海贫血等遗传性疾病的治疗然而，这种基因组编辑主食仍有其局限性。

维尔纽斯大学的基因组生物学家Tautvydas Karvelis说：“将编码这些蛋白质的基因装入病毒中，用于将其传递到细胞中，这真的很难。”即使CRISPR核酸酶直接进入细胞，它们的大蛋白质尺寸也存在局限性。例如，常用的Cas9大约有1400个氨基酸残基长。

在最近发表在《Nature Methods》上的一项研究中，苏黎世大学的基因组生物学家Gerald Schwank和他的团队描述了一种微小但高效的核酸酶，它的作用和目前的一些Cas蛋白一样好，但尺寸不到它们的一半

“这就像一种新的工具，可以用于基因组编辑，而不仅仅是一种原则，”Karvelis说，他没有参与这项研究。

2021年，Karvelis发现了一种能够切割DNA的紧凑RNA引导蛋白：TnpB.3与其他CRISPR核酸酶相比，TnpB要小得多，大约有400个氨基酸残基。但TnpB的编辑效率较低，目标范围有限。

因此，Schwank开始着手改善TnpB的业绩。他和他的团队优化了TnpB用于哺乳动物基因编辑，并设计了蛋白质的变体，以提高目标范围。他们还建立了一个机器学习模型来预测指导RNA对一组目标序列的表现，从而为未来的用户省去了多次试验的麻烦。

在未改变状态下，TnpB的编辑效率在0 - 20%之间，低于最小的CRISPR-Cas9同源物CjCas9。Schwank说：“我们问自己，我们是否真的能让TnpB足够高效地使用它。”

所以，团队做了两件事。他们优化了哺乳动物细胞TnpB的密码子序列，并在蛋白质上附加了一个小标签，将其引导到细胞核。研究小组观察到，这种修饰的核酸酶的编辑效率提高了4.4倍，超过了大多数常用的RNA引导的内切酶，包括CjCas9。他们称这种变异为TnpBmax。

当在插入哺乳动物细胞的大量靶位点文库中进行测试时，TnpBmax表现出色，导致DNA序列的插入和缺失率约为70%。但是，任何改变DNA目标上游重要的五个碱基区域都会导致效率急剧下降。这个序列为5 ‘ TTGAT 3 ’的短区域被称为转座子邻近基序（TAM），它很少出现，限制了TnpBmax发挥其魔力的地方。

为了放宽这些限制，Schwank和他的团队测试了TnpBmax和TAM变体不同版本之间的相互作用。在第76位用丙氨酸代替赖氨酸，TnpBmax可以识别第二位置有胞嘧啶或胸腺嘧啶，第三位置有鸟嘌呤或胸腺嘧啶的TAM。这个序列在基因组中比原来的TAM多出现四次。TnpBmax或TAM的变化不影响编辑效率。

Schwank想在这个工具中加入一个额外的特性。他和他的团队建立了一个模型，可以预测一个引导RNA序列是否能以至少70%的效率编辑给定的DNA序列。“以前，这或多或少是一场赌博。拥有TAM站点意味着，原则上，该站点应该是可定位的，但人们并不真正知道是否会有实质性的效率，”Schwank说。“现在，有了这个模型，就更容易弄清楚你是否可以使用这个工具。”

“有了这个模型，人们就可以设计自己的指南，这将有助于提高系统的可用性，”哈佛医学院（Harvard Medical School）的基因组工程师Omar Abudayyeh说。他没有参与这项研究。

最后，为了对该工具进行最终测试，作者将小鼠大脑和肝脏中的基因作为目标。他们观察到编辑效率分别为65%和75%。在肝脏中，研究小组编辑了一个与胆固醇代谢有关的基因，并观察到小鼠血液中胆固醇水平的下降。

“在他们发现的时候，TnpBs作为基因组编辑酶的效果有多大，这是一个很大的问题，”哈佛医学院（Harvard Medical School）的基因组工程师Jonathan Gootenberg说，他没有参与这项研究。“有了这种设计，他们真的很有竞争力。”