一种新的聚合酶减少了法医DNA分析中的“口吃”

一种突破性的酶旨在解决几十年来一直挑战法医分析的持久DNA产物。

　　

当电视节目《犯罪现场调查》（CSI: Crime Scene Investigation）描绘法医实验室的DNA处理过程时，DNA匹配的结果立即出现，几个小时内就能结束案件。然而，分析法医DNA的幕后过程要复杂得多，需要仔细解读数据。

法医DNA分析使用聚合酶链反应（PCR）来扩增短串联重复序列（STRs），这是高度可变的DNA区域，通常具有四个重复碱基。这种可变性有助于法医科学家识别个体。然而，在PCR过程中，聚合酶可能会在重复序列上滑动，产生“断断续续”的峰——比真正的峰短一个重复的片段。

自从PCR出现以来，科学家们已经开发出过滤器来管理可预测的不连贯，但在解释DNA图谱时，它仍然是一个令人沮丧的问题。“当我们处理DNA混合物时，这尤其困难，”棕榈滩县警长办公室法医生物学部门的法医科学家兼经理Julie Sikorsky说。DNA的含量可能会有所不同。“你有这些痕量贡献者，这些等位基因峰值要么被不连贯掩盖，要么你可以把等位基因峰值解释为不连贯。”

许多研究人员试图解决这一挑战，但他们取得了有限的成功。最近，在人类身份识别国际研讨会（ISHI）上，Promega公司的科学家们宣布了一种新型DNA聚合酶，可以大大减少不连贯。

“当我们几年前开始我们的项目时，我们认为这是不可能的，因为很多人之前尝试过，但都没有成功，”Promega的生物化学家Bob McLaren说。

当McLaren和他的同事们着手这项艰巨的任务时，他们把重点放在了一个关键问题上：为什么不连贯首先会发生？Promega的生物化学家David Mokry说：“我们的假设是，链滑脱或结巴是由DNA与它所结合的DNA聚合酶的滑脱引起的，而DNA聚合酶正在进行聚合。”

他们探索了各种聚合酶和DNA结合域的组合，重点关注自然界的结构基序。他们特别被T7 DNA聚合酶的特征所吸引，这种聚合酶来源于感染大肠杆菌的T7噬菌体，因为它能够通过结合和长时间保持附着来合成长段DNA。

该团队专注于T7 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域（TBD），其结构与大多数耐热性聚合酶（包括Taq）相似。细胞中普遍存在的硫氧还蛋白与TBD结合，引发构象变化，帮助TBD增强聚合酶的活性。McLaren说：“因此，这与我们是否必须通过让DNA（聚合酶）更紧密地结合在活性位点的DNA上来提高加工效率是一样的。”

他们的目标是通过结合T7 DNA聚合酶的这一特征来改进Taq聚合酶。他们设计了一种改良版的Taq聚合酶，将硫氧还蛋白连接到TBD上，并将该区域定位在活性位点附近，聚合酶将核苷酸添加到正在生长的DNA链上。Mokry开始了他的实验，用他们的嵌合DNA聚合酶进行扩增。然后，他把样品交给Promega的生物化学家Nick Courtney，进行毛细管电泳，分离扩增的片段，并检查数据峰。

当Courtney看到这些数据时，他简直不敢相信自己的眼睛。“我带着我的笔记本电脑，跑到大卫的办公桌前，我想，‘哦，天哪，你必须看看这个’，因为它不仅工作，而且在一天内从不工作变成了相当不错的工作。”

他们在所有基因位点上的不连贯都减少了85%。但该团队想要进一步改进它。利用机器学习，他们分析了氨基酸序列，以识别增强聚合酶与其模板链结合的突变。然后，他们在两个和五个贡献者的混合物中测试了改进的酶，并观察到不连贯进一步减少到低于噪音水平。此外，这种酶的工作流程和灵敏度与传统的STR系统相当。

这个开发和提炼过程花了几年时间。当团队在国际法医科学研究所宣布他们期待已久的突破性成果时，Sikorsky回忆说，观众的反应是震惊的沉默和兴奋的混合。Sikorsky与不连贯作了几十年的斗争，她没有参与这种酶的开发，但她对这种新酶及其简化案件DNA分析的潜力表示乐观。“能够整合这样一个工具将会给这个领域带来革命性的变化。”她补充说：“因此，不必担心不连贯高峰，它增加了我们对DNA解释的信心，这使我们能够更准确地估计出贡献者的数量。”

虽然这种酶还没有商业化，但研究小组正在开发一种试剂盒，供法医分析人员使用。

Promega公司已经为这种酶申请了用于STR分析的专利。