伯托NightSHADE影像系统--植物研究利器（下）

书接上回

上回我们介绍了来自德国伯托（Berthold）的植物活体成像系统NightSHADE的优异性能以及部分应用（植物生长发育、植物抗病、植物产量调控、生物节律、信号转导、植物抗逆，详见伯托NightSHADE影像系统--植物研究利器（上））。相信大家对该系统在不同领域的应用还意犹未尽。本期我们一起解锁德国伯托（Berthold）的植物活体成像系统NightSHADE的更多应用吧。

应用举例

1 植物次生代谢

这篇发表在New Phytologist上的文章揭示了两种叶绿体定位的MORF蛋白（MORF2和MORF9）在拟南芥中作为分子伴侣维持四吡咯生物合成(TBS)和胚胎发育中的关键作用。研究人员使用NightSHADE进行荧光素酶互补成像分析，检测和可视化MORF2与四吡咯生物合成途径中相关酶和调节因子在植物中相互作用。具体来说，研究者将MORF2与TBS途径中的22种不同的酶和调节因子分别与荧光素酶的N端和C端融合，然后共转化到烟草叶片中。研究结果显示，MORF2与16种TBS酶或调节因子发生了相互作用。这项实验的结果揭示了MORF2在四吡咯生物合成途径中的潜在作用，表明它可能通过与多种酶和调节因子的物理相互作用来调控这一途径。这对于理解MORF2在植物叶绿体功能和发育中的作用至关重要。

图1. MORF2 与本氏烟叶中的多种四吡咯生物合成 (TBS) 酶和调节剂相互作用。(a) TBS 通路图。ALA，5-氨基乙酰丙酸；Proto IX，原卟啉 IX；MgP，镁原卟啉 IX；MgPMME，镁原卟啉 IX 单甲酯；Pchlide，3,8-二乙烯基原叶绿素。黄色区域表示 TBS 的常见步骤，红色区域表示血红素分支，绿色区域表示 Chl 分支。(b) 荧光素酶 (LUC) 互补成像测定。MORF2 和 TBSs/PPR 分别与萤火虫 LUC 的 N 和 C 末端融合。将构建体共转化到本氏烟叶中，并在渗透2-3天后监测发光情况。

2 育种筛选

这篇发表在PNAS上的文章通过使用CRISPR/Cas9技术敲除水稻中的OsPDCD5基因，发现这一基因的失活能够显著提高水稻的产量和改善其株型，同时揭示了OsPDCD5在调控水稻生长发育中的重要分子机制，为培育高产优质水稻新品种提供了潜在的基因资源。研究人员使用NightSHADE进行分裂荧光素酶实验。这个实验的目的是验证OsPDCD5与OsAGAP两个蛋白之间的相互作用。研究人员将OsPDCD5和OsAGAP的编码序列分别与荧光素酶的N端（nLUC）和C端（cLUC）融合。并借助农杆菌进行瞬时表达分析。结果显示OsPDCD5和OsAGAP在细胞内可以发生直接的相互作用。这种相互作用可能在调控水稻株型和产量方面发挥重要作用，因为OsAGAP已知参与调节生长素的极性运输，而OsPDCD5的敲除影响了与生长素、赤霉素和细胞分裂素生物合成及信号传导相关的基因表达。

图2. OsPDCD5 和 OsAGAP 的相互作用。（A）OsPDCD5 与 OsAGAP 的酵母双杂交试验。将 OsAGAP 和 OsPDCD5 的全长编码序列克隆到 AD（猎物质粒 pGADT7）或 BD（诱饵质粒 pGBKT7）中。用质粒转化的酵母细胞在对照 SD-LT 培养基和选择性 SD-LTHA 培养基中生长。（B）Pull-down 试验。OsAGAP与GST标签融合，OsPDCD5与MBP标签融合。将两种蛋白质共孵育后，用谷胱甘肽-Superflow 树脂进行免疫沉淀，并使用抗MBP抗体进行检测。（C）分裂荧光素酶试验。OsPDCD5和OsAGAP分别与萤火虫荧光素酶 (LUC) 的 N 端 (nLUC) 和 C 端 (cLUC) 部分融合。将不同组合的构建体农杆菌浸润到烟草叶中，并在添加底物荧光素后进行化学发光成像。

3 表型调控——分蘖

这篇发表在New phytologist上的文章主要研究了PIL转录因子家族在小麦、水稻和拟南芥中通过与SPL转录因子相互作用调控植物分枝和分蘖的分子机制。研究人员使用NightSHADE进行荧光素酶互补成像分析，旨在检测小麦中的PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR-LIKE 1（TaPIL1）与SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（TaSPL3/17）之间的相互作用。实验结果显示，在共表达nLUC-TaPIL1和cLUC-TaSPL3/17的样品中检测到了明显的发光信号，这表明TaPIL1与TaSPL3/17在植物细胞内存在物理相互作用。这项实验的结果支持了TaPIL1与TaSPL3/17相互作用的假设，并为进一步研究它们在小麦分枝调控中的功能提供了重要依据。

图3. 小麦 PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR-LIKE 1 (TaPIL1) 和 SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (TaSPL)3/17 的物理相互作用测定。（a、b）本氏烟叶的双分子荧光互补测定显示 TaPIL1 和 TaSPL3/17 之间的相互作用。nYFP/cYFP、nYFP/TaPIL1-cYFP 和 TaSPL3-nYFP/cYFP 或 TaSPL17-nYFP/cYFP 构建体分别渗入本氏烟叶的左上、右上和左下部分。四个共表达样品用作本测定中的阴性对照。TaSPL3-nYFP/TaPIL1-cYFP 和 TaSPL17-nYFP/TaPIL1-cYFP 构建体渗入相应本氏烟叶片的右下四分之一，以此叶片作为实验组。YFP，黄色荧光蛋白。(c) 本氏烟叶片的荧光素酶 (LUC) 互补成像测定显示 TaPIL1 和 TaSPL3/17 之间的相互作用。(d) 本氏烟叶片的共免疫沉淀测定显示 TaPIL1 和 TaSPL3 之间的相互作用。TaPIL1-MYC 和 TaSPL3-Flag 用抗 MYC 抗体免疫沉淀，并用抗 MYC 或抗 Flag 抗体探测免疫印迹。IP，免疫沉淀。

4 病毒感染机制

这篇发表在Molecular Plant上的文章研究了南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）如何通过其编码的P6蛋白调控水稻的乙烯信号，以协调病毒在水稻中的感染和通过昆虫媒介的传播。在这篇文章中，NightSHADE系统被用于检测水稻叶片中由农杆菌介导的瞬时转化后的荧光素酶活性，以验证SRBSDV P6蛋白与OsEIL2和OsRTH2相互作用的情况。结果表明，P6与OsRTH2的相互作用激活了乙烯信号有助于病毒的增殖。在感染的晚期，P6进入细胞核并与OsEIL2互作，抑制了乙烯信号。这种抑制作用导致水稻对昆虫媒介更具吸引力，从而促进了病毒通过昆虫媒介的传播。这些发现为理解SRBSDV如何通过P6蛋白调控水稻的乙烯信号提供了重要信息，这对于揭示病毒如何在水稻中传播以及如何通过昆虫媒介传播具有重要意义。

图4. （A）通过荧光素酶互补成像测定确定 P6 和 OsRTH2 之间的相互作用。含有不同质粒组合的农杆菌被渗入到本氏烟叶的不同区域。在农杆菌渗入后 3 天记录荧光素酶活性。（B）通过荧光素酶互补成像测定法确定本氏烟叶中 P6 和 OsEIL2 之间的相互作用。

5 叶绿体研究

这篇发表在Cell reports上的文章研究了植物叶绿体CDC48复合体在泛素依赖性降解叶绿体内蛋白质中的作用，进而发现CDC48复合体对植物耐受氧化应激至关重要。研究人员使用荧光素酶互补实验研究植物体内CDC48复合体的组分UFD1B和NPL4A是否与叶绿体蛋白RbcL和AtpB在体内发生相互作用。结果表明表明CDC48复合体的组分UFD1B和NPL4A确实与叶绿体蛋白RbcL和AtpB在植物体内发生相互作用。这一发现为理解CDC48复合体在叶绿体内蛋白质泛素依赖性降解中的作用提供了重要的分子证据。

图5. UFD1 和 NPL4 与叶绿体蛋白 RbcL 和 AtpB 发生物理相互作用 (A) 酵母双杂交试验。CDC48A、UFD1B 和 NPL4A 与 GAL4 DNA 结合域 (GBD) 融合；RbcL 和 AtpB 与 GAL4 激活域 (GAD) 融合。SD-WL，培养基缺乏 Trp 和 Leu；SD-WLHA，培养基缺乏 Trp、Leu、His 和 Ade。(B) 荧光素酶互补成像 (LCI) 试验。UFD1B 和 NPL4A 与荧光素酶的 N 端 (nLUC) 融合，RbcL 和 AtpB 与 LUC 的 C 端 (cLUC) 融合。各种质粒组合共渗入本氏烟草叶中。(C) CoIP 试验。野生型 (WT) 和 ufd1b 突变体幼苗在 MS 培养基上生长 7 天，蛋白质提取物用抗 UFD1B 抗体进行 IP。(D) CoIP 测定。WT 和 35S:NPL4A-GFP 幼苗在 MS 培养基上生长 7 天，蛋白质提取物用抗 GFPmAb-琼脂糖进行 IP。(E) CoIP 测定。WT 幼苗在 MS 培养基上生长 7 天，蛋白质提取物用抗 CDC48A 抗体进行 IP。未加抗 CDC48 抗体孵育的总蛋白质提取物作为 IP 的阴性对照。对于 (C)–(E)，箭头表示抗体沉淀的特定蛋白质，星号表示非特异性条带。

6 光合作用

这篇发表在Nano Research上的文章展示了石墨烯能够被水稻叶绿体吸收并转运至类囊体，通过促进光系统II的电子转移和作为活性氧种清除剂，显著增强了水稻叶绿体的光合磷酸化和ATP产生。NightSHADE 系统被用于测量和记录水稻叶片的延迟荧光。这是一种用于研究光合作用中电子转移和光系统II（PS II）活性的技术。研究人员通过测量延迟荧光的强度，评估石墨烯对水稻叶绿体光合作用活性的影响。选取均匀的水稻幼苗，转移到含有特定浓度石墨烯悬浮液的250 mL烧杯中。一天后，将水稻植株放置在黑色纸板上，并用LED面板进行照明，LED通道设置为470, 660和730 nm。关闭光源后，使用NightSHADE系统获取图像，延迟荧光检测时间为480秒。实验结果显示，经过石墨烯处理的水稻叶片展现出更强的延迟荧光信号，这表明石墨烯可能增强了PS II的活性，从而提高了光合作用的效率。

图6. 石墨烯对体内叶绿体光合作用活性的影响。（a）经或未经石墨烯处理的水稻植株的延迟荧光。将水稻植株暴露于0（对照）或100μg/L石墨烯悬浮液（石墨烯吸收）中1天。（b）从（a）获得的延迟荧光强度。（c）从暴露于0或100 μg/L石墨烯悬浮液的水稻叶片中获得的叶绿体的延迟荧光。（d）从（c）获得的延迟荧光强度。（e）使用100 μg/L石墨烯悬浮液喷洒的水稻植株的延迟荧光。误差线代表标准差。每组测量五次重复。采用单因素方差分析（ANOVA）确定处理之间的显著差异。*符号表示与对照有显著差异（P < 0.05）。

7 氧化应激反应调控

The Plant Cell上的一文The Arabidopsis Mediator Complex Subunit 8 Regulates Oxidative Stress Responses 研究了拟南芥中复合体亚基MED8在调控氧化应激反应，特别是通过影响水杨酸和茉莉酸相关防御信号通路中的基因表达，进而影响植物对氧化损伤的耐受性。NightSHADE系统被用来捕捉和记录拟南芥幼苗的生物发光信号。使用了含有荧光素酶报告基因的转基因拟南芥植物，该基因置于一个由氧化应激诱导的启动子（EAL4的启动子）控制之下。分析在不同处理条件下（如过氧化氢、NaCl、mannitol、ABA、MV等）转基因拟南芥幼苗的生物发光图像。通过成像分析，定量评估氧化应激诱导的基因表达变化。结果显示在氧化应激条件下，如过氧化氢和MV处理，转基因拟南芥幼苗的生物发光信号显著增强，表明EAL4启动子驱动的LUC报告基因表达增加。通过筛选和分析突变体（如med8突变体），研究人员发现MED8亚基在调控氧化应激反应中起着重要作用，特别是在调节水杨酸途径和细胞死亡方面。med8突变体在氧化应激条件下表现出更高的耐受性，并且与防御信号传导途径的转录激活有关。这些结果表明，MED8是调控氧化应激反应的关键组分，并且通过影响特定防御信号通路的基因表达来发挥作用。

图7. 鉴定 MED8 为 EAL4 表达的负调节因子。在多孔板中生长的 10 日龄幼苗的照片（左）、ProEAL4:LUC 和 ceal5 幼苗在用 10 mM H2O2 处理 6 小时之前和之后的 PSII 效率 Fv 0 /Fm 0（中）和发光图像（右）。Fv 0 /Fm 0 和发光以从低到高的色标进行可视化。

划重点

德国伯托（Berthold）作为世界上第一个活体动（植）物光学影像系统的生产者，凭借其前沿的技术、精细的工艺为全球众多知名医校、科研院所和制药公司提供服务。Berthold NightSHADE作为一款顶尖的生物成像设备，更是凭借其卓越的性能和广泛的应用，为生命科学的研究和发展提供了新的支持和助力，并赢得了全球科研人员的青睐。Berthold NightSHADE全球装机数百台，发表了大量的高质量文献。其优势总结如下：

1. 超高灵敏度和分辨率。

2. 优异的荧光系统，可以通过软件调节能量的同时，其荧光激发光能量反馈稳定系统保证了激发光能量的一致性。

3. 专为植物而生的侧视成像模块，在不影响植物生长(如根的向地生长等)的情况下，观察植物的根、茎等器官内目标基因的表达情况。

4. 植物光照系统，可调节光照高度、波长及每个波长能量的光照系统，让实验人员在整个实验过程中无需移动植物，同时也让实验结果更加准确。

5. 丰富的配件，大大拓展了NightSHADE的应用。

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