在空间转录组学研究中解锁FFPE样本的潜能

空间转录组学的出现，为探索细胞的空间结构及其在组织背景下的相互作用提供了新的可能性。空间转录组学要获得高质量的数据，样本质量至关重要。本文介绍了一些新方案，有助于您在空间转录组学实验中成功使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。

FFPE样本面临的挑战

FFPE方法通常是保存临床标本的首选方法，具有简单易用、经济高效、完好保留形态细节等优点。世界各地的生物样本库中储存了大量的FFPE样本，这些样本对基因组学研究和大规模纵向研究来说都很宝贵。

即使是在长期储存后，FFPE样本仍然很好地保留了组织形态。不过，与新鲜冷冻组织相比，福尔马林固定过程中的亚甲基交联会严重破坏组织，导致核酸完整性受损，基因信息减少。FFPE样本中的RNA分子往往是片段化的，而降解也会影响RNA的polyA尾巴。

为此，多家公司推出新颖的解决方案，以解决这些难题，并提高FFPE样本的mRNA回收率。

直接探针法检测

10x Genomics近日推出了一系列产品，能够对片段化RNA进行可靠检测，并耐受一定量的RNA降解。10x Genomics高级产品经理Julia Cowen解释说：“我们的Visium和Xenium分析利用直接探针检测，而不是逆转录，因此不需要全长RNA。我们还优化了样本制备方案，使其对核酸更温和，以避免RNA降解。”

“我们的Visium v2和Visium HD分析检测的是全转录组，包含多对探针。每对探针都包含一个左侧（LHS）探针和一个右侧（RHS）探针，靶向一个特定的基因。平均而言，每个基因靶点有三对探针，” Cowen谈道。

“LHS和RHS探针必须与mRNA靶点结合形成连接产物，然后被Visium载玻片捕获并进行空间定位。”这种复杂的探针设计，包括3倍基因覆盖度和双探针结合事件，确保了高的灵敏度和特异性，能够对降解的mRNA分子进行特异检测。

Xenium探针是另一种创新的解决方案，它的两个区域可独立与目标RNA杂交，同时还含有基因特异性的条形码序列。“探针末端的结合及其相互间的连接会生成环状的DNA探针，然后进行酶促扩增，”Cowen指出。“如果探针的一部分发生脱靶结合，就不会形成连接，从而抑制脱靶信号，确保高特异性。”

这些Visium和Xenium分析经过精心设计，适用于多种FFPE组织，且用户无需进一步优化。即使在处理RNA质量较低的样本时，这些分析也能提供可靠的性能。Cowen建议使用DV200值高于30%的组织，但评分较低的组织块也能获得数据，只是灵敏度可能较低。此外，她还建议采用组织学染色（H&E）来评估组织块的质量，确保组织形态的完整性。

瑞典皇家理工学院Joakim Lundeberg团队利用10x Genomics的Visium平台开发出一种新方案，能够对各种FFPE组织进行无偏的全基因组空间分析。作者强调，利用FFPE组织获得的空间转录组数据与新鲜冷冻组织的数据有很强的相关性，而且足以用来描述解剖学特征。

RNA和蛋白质的联合检测

Standard BioTools公司（原Fluidigm）和Advanced Cell Diagnostics（Bio-Techne旗下公司）开发出一种新颖的工作流程，能够同时检测FFPE样本中的RNA和蛋白质标志物，而没有光谱重叠或自发荧光的困扰。

这种方法将成像质谱流式技术（IMC™）和RNAscope™流程相结合，让研究人员能够更深入地了解肿瘤微环境中复杂的细胞相互作用。值得注意的是，这个流程经过优化，适用于FFPE样本，可确保高质量的结果，并与空间转录组学分析兼容。

Standard BioTools公司的应用科学家James Pemberton博士表示：“凭借IMC的亚细胞分辨率和多重分析能力以及RNAscope的高灵敏度和特异性，这种方法可以研究以往无法接触的靶点和细胞活化状态。”

“这个工作流程支持40多种标志物的分析，包括12种靶向RNA表达的标志物，有助于研究细胞特异性的基因表达，并鉴定分泌因子的细胞来源。研究人员可以先使用RNAscope方案标记mRNA，然后在同一载玻片上使用抗体，通过IMC的金属标签同时分析mRNA和蛋白质。”

为了获得可靠的结果，必须考虑到FFPE样本中可能出现的RNA质量不佳。RNAscope分析的稳定性让它能够检测部分降解的RNA靶点。连续切片的使用可以进一步优化结果。

Pemberton建议使用阳性对照探针来分析一张连续切片上的RNA质量。如果阳性对照探针能成功检测，则表明相邻切片上的RNA质量足够好，可以在您的实验中使用目标探针。如果检测不到阳性对照探针，他建议使用新鲜制备的组织切片。

简单几招教你提高RNA回收率

Cowen指出：“为了提高FFPE样本的RNA回收率，首先必须遵循RNA处理的通用规则，包括使用去除RNase的设备，使用不含核酸酶的水，确保所有试剂不被污染。”

在制备组织切片用于Xenium和Visium空间转录组学分析时，Cowen还建议：

• 在切片前用RNase去污溶液清洗切片设备

• 在切片时使用干净的新刀片

• 在处理组织时使用新鲜试剂

• 将FFPE组织块保存在4°C下，并按照相关的产品说明保存切片

• 使用干净的玻璃器皿：在使用前喷洒RNase去污溶液或高压灭菌

• 在所有步骤中使用不含核酸酶的水和10x推荐的第三方试剂

• 避免在多次实验中重复使用相同的染色缓冲液

结语

由于福尔马林诱导的交联和mRNA分子的降解，开发可靠的方法来实现灵敏的空间转录组学分析一直颇具挑战性。这些新颖的解决方案在克服FFPE样本的局限性方面取得了重大进展，使得高质量的空间转录组学数据更容易获得。

相关文献

1. Mathieson, W., Thomas, G. Using FFPE Tissue in Genomic Analyses: Advantages, Disadvantages and the Role of Biospecimen Science. Curr Pathobiol Rep 7, 35–40 (2019). 

2. Gracia Villacampa E, Larsson L, Mirzazadeh R, et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genom 8;1(3):100065 (2021).