【科研动态】华中科技大学生命学院朱斌课题组揭示体外转录RNA合成中全长双链RNA副产物的产生机制并针对开...

　　

2024年7月10日,华中科技大学生命科学与技术学院朱斌教授团队在国际核酸领域权威期刊《Nucleic Acids Research》发表题为“DNA-terminus-dependent transcription by T7 RNA polymerase and its C-helix mutants”的研究论文。

论文链接：

https://academic.oup.com/nar/advance-article-abstract/doi/10.1093/nar/gkae593/7709539?utm_source=advanceaccess&utm_campaign=nar&utm_medium=email

当前生物医学已迎来了RNA时代，mRNA药物和疫苗崭露头角便引起变革，而RNA的体外合成恰是RNA研究和应用的限制瓶颈。化学合成法合成RNA的极限长度在一百个核苷酸左右，目前制备长链RNA的唯一方法是上世纪80年代Uhlenbeck等建立的体外转录，即利用天然的RNA合成机器-DNA依赖的RNA聚合酶，在体外从带有相应转录启动子序列的DNA模版上反复转录线性扩增产生所需的RNA。然而自然界绝大部分的RNA聚合酶都具有非常复杂的亚基组成和调控机制，无法用作体外标准可控高产的RNA合成工具酶，因而上世纪70年代Studier等从噬菌体T7中发现的单亚基RNA聚合酶垄断了当前的RNA体外合成技术。受限于具有单亚基RNA聚合酶的噬菌体的稀少及研究难度，自上世纪80年代以来再无其他研究团队对新型噬菌体单亚基RNA聚合酶的研究报道。而朱斌团队历时10余年建立了国际上唯一系统性发掘新型噬菌体单亚基RNA聚合酶的研究方向，报道了新世纪以来所有的新型（Syn5、KP34及VSW-3）噬菌体单亚基RNA聚合酶转录系统的功能研究及其体外转录应用，分别针对性改善了T7 RNA聚合酶的一些缺陷，其中来自云南香格里拉高原冰湖的VSW-3 RNA聚合酶独特的低温合成可显著降低mRNA中的双链RNA污染，目前已在美国以Ice lake RNA polymerase为商标投入商业化应用（ribotech.us）。但目前的mRNA合成规范已高度适配于T7 RNA聚合酶，例如转录DNA模版、帽类似物、高产反应条件等均为T7 RNA聚合酶的性质所标准化，因此短期内开发性能改进的T7 RNA聚合酶突变体将更快推动RNA研究和mRNA药物疫苗应用。

对mRNA药物疫苗影响最大的T7 RNA聚合酶转录副产物当属双链RNA（dsRNA）。dsRNA尤其是长dsRNA模拟病毒基因组信号，即使微量也会引起强烈的细胞免疫排斥效应，造成mRNA细胞毒性。业界目前普遍认为dsRNA来源于T7 RNA聚合酶的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）活性，即以单链RNA自身为模版复制dsRNA。朱斌课题组前期报道的T7 RNA聚合酶S43Y突变体可有效降低T7 RNA聚合酶的RdRp活性以减弱这一来源的dsRNA。但在多项相关研究中，课题组发现T7 RNA聚合酶的RdRp延伸性有限，只能合成很短的dsRNA，无法说明长dsRNA的产生机制。

本工作对细胞毒性效应最大的全长dsRNA的来源进行了详细研究，清晰展示了全长dsRNA的真正来源：T7 RNA聚合酶会在没有启动子的的DNA末端开始转录，一般从倒数第二个碱基位置开始合成与目标RNA完全互补的反向RNA，反向RNA进而与目标RNA形成完全配对的全长dsRNA。DNA模版最末端的序列对全长dsRNA的产量有较大影响。作者比较了各类单亚基RNA聚合酶的DNA末端起始转录的情况，发现在已鉴定噬菌体单亚基RNA聚合酶中只有KP34和VSW-3 RNA聚合酶缺乏DNA末端起始能力，因此检测不到其产生的全长dsRNA。进而根据前期研究经验和不同酶之间的比较，朱斌课题组分析了T7 RNA聚合酶多种C-helix突变体的DNA末端结合和起始转录能力，发现G47W突变可显著降低T7 RNA聚合酶对DNA末端的结合，因而可以最有效减少全长dsRNA的产生。美国Moderna公司近期报道的G47A+884G突变体可有效减少RdRp引起的dsRNA，但在合成长链RNA时或在高产条件下该突变体的RNA产量显著降低。相比之下，G47W突变对蛋白质表达纯化及RNA合成产量均无显著影响，完全适配当前野生型T7 RNA聚合酶的标准反应和配套条件，是降低全长dsRNA最简单有效的方法。

华中科技大学生命科学与技术学院博士研究生余兵兵与陈逸凡为论文共同第一作者，华中科技大学为论文唯一单位，华中科技大学生命科学与技术学院朱斌教授为通讯作者。本研究受到国家自然科学基金原创探索项目和生物医学峰基金支持。