我院夏宁邵、葛胜祥、张师音团队开发一种肠道病毒超多重核酸分型检测技术

　　

肠道病毒是一类在全球广泛流行的小RNA病毒，每年导致超过10亿例新发感染，引发包括呼吸系统、皮肤、神经系统和胃肠道问题等在内的多样疾病。目前已鉴定出300余种血清型，不同型别的流行此起彼伏，且在疫苗的筛选压力下，非主要型别的比例正在上升，新型别的流行也不断出现。因此，无论是对于医疗救护还是疫情防控，均迫切需要监测和鉴定这些肠道病毒型别。现有的肠道病毒分型技术各有局限：病毒中和试验耗时且复杂；基因测序过程缓慢且依赖专业设备和生物信息学分析；核酸杂交技术能够检测更多型别，但敏感性和特异性不及PCR。单管多重PCR提供了相对快速、灵敏的检测方法，但仅能实现3-4个血清型/管的检测，无法满足众多肠道病毒同时鉴定的需求。而设计无相互干扰的引物对在单管超多重检测中极具挑战，且荧光定量PCR仪器的有限检测通道也制约了靶标数的扩展。

针对上述局限，我院夏宁邵、葛胜祥、张师音团队开发了一种序列特异性荧光编码微球（sequence-specific nanoparticle barcode，SSNB）多重核酸检测技术。SSNB技术将靶标特异引物共价偶联至带有不同荧光编码的微球表面，将不同靶标的扩增以颗粒为单位分隔至相对独立的物理空间中，有效避免了常规多重检测中各靶标引物之间、不同靶标引物与模板之间的错配，从而保障了多重扩增的特异性与灵敏度。同时，SSNB技术所采用的微球，最高可实现500种荧光信号编码，每种荧光均可成为该微球表面扩增靶标的唯一编码。通过对微球内部荧光的解码，可判定对应检测靶标属性；而微球表面扩增产物的荧光信号则可指示阴阳性。由此，SSNB在解决传统多重扩增灵敏度与特异性不足问题的同时，亦突破了荧光定量PCR仪检测通道的限制，理论上可实现最高500重的检测。

检测原理示意图

基于SSNB技术，研究人员研制出可在一管内对10种高流行的肠道病毒进行分型检测的方法，在型别鉴定中展示出与测序技术100%的一致性，且具备对多型别共感染的鉴定能力。SSNB在提供超多重分析的同时，其呈现出的分析灵敏度显著提升，相比已报道的多重杂交基因分型技术可提升10-10^6倍，临床样本分析中与逐个型别进行分析的单重PCR灵敏度水平相当，并大幅缩短检测耗时并减轻鉴定工作量。作为临床检验工具，SSNB展现出理想的批内及批间可重复性，结果正确可靠。更为重要的是，由于SSNB中每重反应均可形成独立的扩增微环境，不受其他靶标扩增的影响，因此，在需要对新病原进行鉴定时，仅需在体系中补充新引物编码的微球即可，而无需大动干戈式的重新系统调整全部的扩增与检测体系，因此具备更好的靶标拓展性和灵活性。SSNB技术在肠道病毒分型检测中成功应用，验证了其具备理想的敏感性与特异性、超多重检测能力、新靶标拓展能力，以及其无需专业生物信息学分析所带来的便利性。未来，该技术还可应用于症候群病原体鉴定、多基因遗传病检测、肿瘤高频变异基因检测、多耐药位点分析等不同的核酸超多重靶标分析领域，成为核酸多重检测中一种新型的有力工具。

近日，相关研究成果以题为“Sequence-specific nanoparticle barcode strategy for multiplex human enterovirus typing”的研究论文在线发表于《自然·通讯》（Nature Communications）。我院钟泽澄、苏晓崧、杨坤宇为该论文共同第一作者。我院夏宁邵、张师音、葛胜祥为该论文共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、福建省科技重大专项、福建省卫生健康委员会医学科研计划项目、中国医学科学院创新单元项目、中央高校基本科研业务费专项资金等项目的支持。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-50921-w