海底捞针：揭开细菌群体中的耐药性“麻烦制造者”

同源细菌细胞群体在表型上是异质的，可能包含抗生素耐药或异质耐药的亚群细胞。这些形态上相同但表型可逆且缺乏生物标志物来区分功能的细胞，是研究和临床检测面临的挑战。

　　

想象一下，一个拥有10亿人口的国家，每个人都有不同的兴趣和目标。你永远不会知道他们的兴趣和目标，除非你问他们，但问十亿人不是一件容易的事。这是科学家在研究细菌时面临的同样复杂的情况。在一个铅笔尖大小的菌落中大约有10亿个这样的细菌，但是当我们观察整个菌落时，它们看起来都是一样的，我们假设它们都是同一种抗生素的受害者。不幸的是，事实并非如此。

麻烦制造者

细菌性病原体引起感染的群体由无数的单细胞组成，就像人一样，伤口里的每一个细菌都有自己的目标。有些会茁壮成长并繁殖，有些会迁移到病人身体的其他部位，有些会屈服于抗生素治疗，还有一些会躲藏起来不被注意到——能在抗生素下存活而且不会被诊断性抗生素耐药性测试检测到的，是其中的麻烦制造者。但传统的实验微生物学技术和诊断临床实验室常规通常侧重于分析大量群体，而没有考虑到细菌的个性。

细菌表型异质性可通过内在因素(如随机基因表达、细菌年龄)和外部因素(微环境、细胞间相互作用)产生的，这些因素会影响与细菌生理和应激反应、抗菌药物敏感性或毒力相关的多种性状。异质性可能通过合作行为(劳动分工、共享细胞外资源)以及在不利条件下产生具有适应度优势的特化细菌使细菌群体受益。或者，异质性可能是根据“细胞活力”进行必要的性状调整造成的。

越来越多的文献记录了亚群表型引起的临床相关性和治疗并发症，特别是在慢性感染期间。这其中包括异耐药细菌，即克隆分离株中的细胞亚群，其特征是对某些抗生素的敏感性存在很大差异。另外还包括被称为顽固性细菌的非复制细菌，这些细菌在抗生素治疗中存活下来，而不会产生可遗传的遗传抗性。在抗生素治疗后，顽固性细菌可以恢复到增殖和抗生素敏感表型，引起复发和慢性感染，并促进抗菌素耐药性的进化。顽固性细菌可以在低频率下自发产生，也可以由压力条件触发，如饥饿和其他因素。另一种休眠表型被称为“可存活但不可培养(VBNC)”细菌，通过观察集落形成单位(CFU)和在活力染色的帮助下归类为活细菌之间的差异来鉴定。休眠和抗异源变异体的存在是通过它们在大部分细菌不能生长的条件下生长的能力来回顾性推断的。由于没有生物标志物来区分和分离这些生长表型与功能不同的细菌，要在数千亿细菌中找到这些隐匿的麻烦制造者就像大海捞针一样，很难找到，但它们可以使医疗无效。“我们知道这些麻烦制造者的存在，就像大海捞针一样，因为时不时有人受到伤害。我们还知道，在一些慢性细菌感染中，大海捞针不止一根，”最近一项有关该问题的研究的首席研究员、副教授Christian Lentz说。

用荧光找到有害细菌

挪威北极大学(UiT)和新型抗菌策略中心(CANS)的研究人员发现了一种聪明的新方法，可以观察单个细菌，并在其中找到耐药性细菌或麻烦制造者——研究人员现在甚至可以预测这些耐药菌的行为以及他们会变得多么危险。

研究人员提出了一个“细胞表型分析与回溯追踪(CPPT，Cellular Phenotypic Profiling and backTracing)”平台—— 一种基于荧光激活细胞分选平台(FACS)，使用荧光探针来可视化和量化细胞特性，将其表型特征与单个细胞在生长和抗生素耐药性分析中的实验确定的命运联系起来。首先使用荧光化学探针标记分选细菌，单个细胞被分选后进行单独的下游分析——暴露单细胞在液体或固体培养基中生长的差异能力，很容易检测到生长变异，如不稳定的小菌落和其他双稳态生长表型，在确定细菌命运后再追溯分选时细菌的表型概况（表型回溯）。这个方法不用像单细胞测序一样破坏细菌，而是提供了一种潜在的解决方案，将细菌命运检测(例如确认休眠)与流式细胞术测定的细胞表型谱相结合，允许使用荧光化学探针的不同组合对休眠细菌进行大范围的表型表征，有助于识别出能用于直接检测和富集休眠细胞的标记。更有趣的是，结合简单的单细胞衍生生长试验，CPPT揭示了以前未发现的异质性相关现象，如与菌落特征无关的滞后期双峰分布；在存在抗生素选择的情况下单细胞衍生的生长曲线不是双峰的而是多峰的；有的单细胞亚群可在琼脂上培养但不能在液体培养中培养等。对于在琼脂和液体培养基中不同的“可培养性”，作者假设这是应激细菌的一个特征，可能与已知的休眠表型有关——如在应激下触发的“可存活但不可培养(VBNC)”细菌和顽固性细菌。与琼脂表面的物理接触可能以某种方式帮助应激细胞恢复并开始复制，而浮游单细胞却不能这样做，虽然这一现象背后的分子原因仍有待确定，但这些发现代表了细菌可培养性的一个新的细微差别，并为正在进行的关于细胞何时是活的、可培养的、休眠的或死亡的争论增加了另一个层次的复杂性。这些结果说明了CPPT在揭示细菌生理学和生态学的基本新方面的力量。基于流式细胞术的平台可以在单细胞水平上进行调节，也可以与门控一起使用，对具有特定标记特征的亚群进行分类，用于不同的下游分析，如“组学”研究或感染或毒力相关的分析。

另外在实验中，荧光万古霉素偶联物标记了具有较高抗生素耐受性的金黄色葡萄球菌亚群，这展示了CPPT在发现具有临床相关性的生物标志物方面的价值。

图片来自作者论文：在naïve细菌细胞群的表型性状将可视化使用荧光化学探针和流式细胞术定量。将单细胞分选出来，放入液体培养基中进行生长性能的下游分析，在液体培养基中监测复制，或者在琼脂上通过延时成像监测生长。在功能分析之后，将细胞命运分类为感兴趣的类别，并追溯分选时的表型概况，从而可以检测与动态可逆表型相关的表型特征和发现生物标志物。

Christian Lentz副教授说：我们正在尝试用荧光绿色来描绘“针”，这样很容易被发现。为此，我们使用特殊的分子“颜料”，例如抗生素与荧光染料或其他探针相结合，这些探针可以告诉我们细菌细胞的针状分子组成。将细胞涂成不同的颜色，并将细胞的颜色与它们在抗生素中的生存能力联系起来，这一组合使我们能够预测单个细菌细胞是否更有可能被抗生素杀死。”

更容易选择正确的抗生素

能够了解隐藏在细菌菌落内的抗生素耐药麻烦制造者的类型，对于预测某种抗生素治疗的成功或失败至关重要。这将使首先选择更合适的抗生素变得更容易，可能将有助于避免无法解释的抗生素治疗失败。