外泌体分离和分析，哪种方法适合您？

此时此刻，大量的外泌体（exosomes）正在你的体内忙碌着。这种由质膜包裹的细胞外囊泡含有大量蛋白质和脂质，在细胞间通讯中发挥着直接的作用1。它们参与了许多生理活动，包括免疫力、组织稳态和再生，同时也与多种疾病相关，如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。

考虑到外泌体存在于血液和尿液等容易采样的生物体液中，目前有数百项临床试验以外泌体为重点也就不足为奇了2。事实上，2021年全球外泌体研究的市场规模为1.44亿美元，预计到2026年将达到6.61亿美元3。

目前已有一套成熟的指引来记录外泌体及其他细胞外囊泡的功能活性4。然而，在外泌体分离上却没有一套放之四海而皆准的方案，而且在分析外泌体时也可能需要多种技术。

在分离和分析上缺乏标准方案，这多少阻碍了外泌体的研究5。同时，研究人员也需要鉴别最适合其应用的方案和工具。在此，我们将总结了外泌体分离和分析的一些常用方法，希望能对大家有所启发。

外泌体分离

研究人员通常采用以下几种方法来分离外泌体6。超速离心法是细胞和分子生物学实验中的老牌方法，但速度较慢，分离出的外泌体可能纯度较低。体积排阻色谱法（SEC）和沉淀法快速、便宜且温和，但也存在污染问题。

超滤法所需的样本量最少，但其使用的力量可能会造成外泌体损伤。免疫亲和层析法（IAC）也可以分离外泌体，但从抗体包被的磁珠上洗脱外泌体可能会有点困难。目前还涌现出一些基于微流控技术的外泌体分离方法及其他方法，包括商业化的分离和纯化试剂盒，但还需要进一步验证7。

研究人员在开发外泌体分离的标准程序时，面临着三大挑战。第一，那些乍一看似乎成功的分离程序却可能分离出不具代表性的外泌体亚群（比如外泌体大小或tetraspanin蛋白含量不满足要求）8；第二，分离后的储存条件（比如反复冻融和储存温度）会影响外泌体的特性9；第三，许多实验室定制程序在规模上不满足临床验证或商业用途的需求10。

外泌体分析

许多适用于细胞分析的工具也同样适用于外泌体分析。在此，我们重点介绍一下电化学法和质谱法。

电化学法是外泌体分析的一种直接手段。厦门大学化工学院胡可可副教授和哥德堡大学Andrew Ewing教授领导的研究团队近日引入了微米尺度电化学方法，通过碳纤维微米电极的计时电流法测量，捕捉到了单个活细胞中单个外泌体的动态释放11。

他们发现，神经内分泌细胞释放的外泌体含有儿茶酚胺神经递质。Ewing表示：“众所周知，外泌体中含有蛋白质和RNA等物质，但含有神经递质却是一个惊喜。这可能是细胞间传递化学信息的一种独特方法，目前尚未证实但很有可能。”

韩国建国大学生物工程系Ki Soo Park领导的研究团队在《Analytical Chemistry》杂志上发表文章，回顾了基于信号方法（如荧光法、比色法和化学发光法）的各种外泌体检测方法，并重点介绍了电化学策略12。他们认为这种方法更简单、更经济且更灵敏。

质谱技术也被广泛用于外泌体分析。例如，最近一项对皮肤黑色素瘤外泌体的研究发现了多个蛋白质组标志物，并根据血管生成及其他癌症相关类别对其进行了分类13。此外，通过质谱分析，人们还可以定量外泌体中的数千种蛋白质14。这些信息与各种代谢物进入外泌体的机制有关，有助于了解疾病进展。

专家视角

ZenBio公司是一家从事临床前筛选和药物发现的合同研究机构，他们主要通过超速离心法和体积排阻色谱法来分离外泌体，并对外泌体进行严格的质量控制。这家公司再生医学部门的副总裁John Ludlow表示：“我们在外泌体分离和分析方面拥有十年的经验，正在进一步打开临床应用的大门。我们正在推进疾病、组织工程、再生医学以及诊断和预后方面的外泌体研究。”

Proteintech公司则是单克隆抗体领域的专家，这些抗体是分离和鉴定外泌体以及确定其功能的理想选择。据产品经理Sreethu Sankar博士介绍，他们的抗体可用于“流式细胞术、western blot、ELISA或免疫沉淀等技术，以研究外泌体的动态。通过这些方法，你可以分析外泌体中特定蛋白质或货物分子的表达水平或相互作用。单克隆抗体还可以用来中和某些外泌体表面蛋白，以评估它们在摄取、靶向或信号转导中的作用。”对于外泌体的常见标志物Alix、TSG101和CD9等，Proteintech提供了一些经过验证的一抗。

如今，外泌体不再被认为是细胞垃圾。也许随着研究的不断深入，外泌体的分离和分析会比现在更加简便。

参考文献：

1. Wang X, et al. (2023). Recent progress in exosome research: Isolation, characterization and clinical applications. Cancer Gene Ther. 1–15.

2. Chavda VP, et al. (2023). Exosome nanovesicles: A potential carrier for therapeutic delivery. Nano Today 49:101771.

3. MarketsandMarkets (2022). Exosome research market size, growth by product and services (kits, reagents, instrument), indication (cancer, infectious diseases), application (biomarkers, vaccines), manufacturing services (stem cell, dendritic cell-derived), end user & region - global forecast to 2026. Rep. BT 6939, March. (last accessed Jun. 5, 2023)

4. Thére C, et al. (2018). Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J. Extracell. Vesicles 7(1):1535750.

5. Li X, et al. (2019). Challenges and opportunities in exosome research—Perspectives from biology, engineering, and cancer therapy. APL Bioeng. 3(1):011503.

6. Xu W-M, et al. (2023). Research development on exosome separation technology. J. Membr. Biol. 256:25–34.

7. Chen J, et al. (2022). Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front. Bioeng. Biotechnol. 9:811971.

8. Bettio V, et al. (2023). Extracellular vesicles from human plasma for biomarkers discovery: Impact of anticoagulants and isolation techniques.  PLoS ONE 18(5):e0285440.

9. Gelibter S, et al. (2022). The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. J. Extracell. Vesicles 11(2):e12162.

10. Ahn S-H, et al. (2022). Manufacturing therapeutic exosomes: From bench to industry. Mol. Cells 45(5):284–290.

11. Hu K, et al. (2023). Single exosome amperometric measurements reveal encapsulation of chemical messengers for intercellular communication. J. Am. Chem. Soc. 145(21):11499–11503.

12. Hashkavayi AB, et al. (2020). Advances in exosome analysis methods with an emphasis on electrochemistry. Anal. Chem. 92(19):12733–12740.

13. Surman M, et al. (2023). Similarities and differences in the protein composition of cutaneous melanoma cells and their exosomes identified by mass spectrometry. Cancers 15(4):1097.

14. Vlachakis DP, et al. (2023). Future of exosome bioinformatics. EMBnet J. 28:e1015.