《Nature Methods》前所未有的活体脑组织4D纳米级重建技术

　　

人类大脑拥有大约860亿个神经元组成的复杂网络，可以说是科学家们遇到的最复杂的样本之一。它拥有巨大的，但目前无法估量的信息财富，将其定位为计算设备的顶峰。

掌握这种复杂程度是具有挑战性的，因此我们必须采用先进的技术，在微观层面上解码大脑中发生的微小而复杂的相互作用。因此，成像成为神经科学领域的关键工具。

研究人员开发了一种名为LIONESS的新型成像和虚拟重建技术，该技术可以提供活体脑组织的高分辨率成像，并以实时3D纳米级细节可视化。LIONESS集成了先进的光学、人工智能和跨学科的协作方法，克服了以前成像方法的局限性，为更好地理解脑组织动力学和复杂性铺平了道路。

由ISTA的Johann Danzl团队开发的新成像和虚拟重建技术是成像大脑活动的一大飞跃，并被恰当地命名为LIONESS -实时信息优化纳米镜实现饱和分割。LIONESS是一个对活体脑组织进行成像、重建和分析的管道，具有迄今为止不可能实现的全面和空间分辨率。

“有了LIONESS，第一次有可能对活体脑组织进行全面、密集的重建。通过对组织进行多次成像，LIONESS使我们能够观察和测量大脑中动态的细胞生物学过程，”第一作者Philipp Velicky说。“输出是三维细胞排列的重建图像，时间构成了第四个维度，因为样品可以在几分钟、几小时或几天内成像。”

协作和人工智能是关键

LIONESS的优势在于精致的光学和构成其核心的两个层次的深度学习(人工智能的一种方法):第一级提高图像质量，第二级识别密集神经元环境中的不同细胞结构。

以前，用电子显微镜可以重建脑组织。这种方法根据样品与电子的相互作用对样品进行成像。尽管电子显微镜能够以几纳米(百万分之一毫米)的分辨率捕获图像，但它需要将样品固定在一种生物状态下，需要对其进行物理切片以获得3D信息。因此，无法获得动态信息。

另一种先前已知的光学显微镜技术允许观察生命系统，并通过“光学”而不是物理切割来记录完整的组织体积。然而，光学显微镜的分辨能力受到它用来产生图像的光波的特性的严重阻碍。它的最佳分辨率是几百纳米，粒度太粗，无法捕捉脑组织中重要的细胞细节。

利用超分辨率光学显微镜，科学家们可以打破这个分辨率障碍。该领域最近的工作被称为SUSHI(超分辨率阴影成像)，表明将染料分子应用于细胞周围的空间，并应用获得诺贝尔奖的超分辨率技术STED(受激发射损耗)显微镜，可以显示所有细胞结构的超分辨率“阴影”，从而在组织中可视化它们。

然而，目前还不可能对整个脑组织进行分辨率增强成像，以匹配脑组织复杂的3D结构。这是因为提高分辨率也需要在样品上施加高负荷的成像光，这可能会损坏或“烧焦”细微的活组织。

这就是LIONESS的强大之处，根据作者的说法，它是为“快速和温和”的成像条件而开发的，因此可以保持样本的存活。这项技术同时提供了各向同性的超分辨率——这意味着它在所有三个空间维度上都同样出色——这使得组织细胞成分的三维纳米级分辨率细节可视化成为可能。

在成像步骤中，LIONESS仅从样品中收集所需的少量信息。接下来是第一个深度学习步骤，在一个称为图像恢复的过程中填充有关脑组织结构的额外信息。通过这种创新的方式，它达到了大约130纳米的分辨率，同时足够温和，可以实时成像活体脑组织。总之，这些步骤允许深度学习的第二步，这一次是理解极其复杂的成像数据，并以自动化的方式识别神经元结构。

Danzl说:“跨学科的方法使我们能够打破在分辨能力和光暴露于生命系统方面交织在一起的限制，理解复杂的3D数据，并将组织的细胞结构与分子和功能测量相结合。”

       为了进行虚拟重建，Danzl和Velicky与视觉计算专家合作:ISTA的Bickel小组和哈佛大学Hanspeter Pfister领导的小组，他们在自动分割(自动识别组织中细胞结构的过程)和可视化方面贡献了他们的专业知识，并得到了ISTA图像分析工作人员科学家Christoph Sommer的进一步支持。对于复杂的标签策略，来自爱丁堡、柏林和ISTA的神经科学家和化学家做出了贡献。

因此，有可能桥接功能测量，即读出细胞结构与生物信号活动在同一个活神经元回路。这是通过成像钙离子通量进入细胞和测量细胞电活动与乔纳斯组在ISTA合作完成的。诺瓦里诺小组贡献了人类大脑类器官，通常被戏称为模仿人类大脑发育的迷你大脑。这组作者强调，所有这一切都是由ISTA一流科学服务单位的专家支持促成的。

大脑结构和活动是高度动态的;它的结构随着大脑执行和学习新任务而进化。大脑的这一方面通常被称为“可塑性”。因此，观察大脑组织结构的变化对于解开其可塑性背后的秘密至关重要。ISTA开发的新工具显示了通过揭示亚细胞结构并捕捉这些结构随时间变化的方式来理解脑组织和其他器官的功能结构的潜力。

参考文献:

“Dense 4D nanoscale reconstruction of living brain tissue” by Philipp Velicky, Eder Miguel, Julia M. Michalska, Julia Lyudchik, Donglai Wei, Zudi Lin, Jake F. Watson, Jakob Troidl, Johanna Beyer, Yoav Ben-Simon, Christoph Sommer, Wiebke Jahr, Alban Cenameri, Johannes Broichhagen, Seth G. N. Grant, Peter Jonas, Gaia Novarino, Hanspeter Pfister, Bernd Bickel and Johann G. Danzl, 10 July 2023, Nature Methods.