完全修饰miR-34a microRNA治疗成功减缓肿瘤生长 miRNA药物再度引起关注

由于p53缺陷、表观遗传沉默和基因组缺失的改变，microRNA miR-34a是临床最相关的肿瘤抑制microRNA之一。美国普渡大学研究人员合成了miR-34a的完全修饰版本(FM-miR-34a)，提高稳定性而不影响其活性，克服稳定性差、非特异性递送和递送相关毒，有望让大量癌症患者从miR-34a替代中受益。

　　

研究摘要

癌症几乎可以发生在人体的任何部位。它的特点是细胞分裂不受控制，甚至逃避免疫系统。miRNA是短的非编码RNA，具有同时下调多个基因的独特能力。由于p53缺陷、表观遗传沉默和基因组缺失的改变，microRNA miR-34a是临床最相关的肿瘤抑制microRNA之一，其靶点包括雄激素受体(AR)、C-MYC、AXL、MET、SIRT1、CD44、PDL-1等，可参与调控细胞增殖、迁移和侵袭、抵抗凋亡和免疫逃避的几种致癌途径。但是，miRNA稳定性降低、未修饰RNA的潜在免疫原性以及缺乏安全的递送载体，阻碍了miRNA在临床的应用前景。未经修饰的miRNA会被核酸酶迅速降解而降低活性，需要使用更高剂量和重复使用。毫无疑问，如果能够克服miR-34a稳定性差、非特异性递送和递送相关毒性，那么可能会有大量癌症患者将从miR-34a替代中受益。美国普渡大学的研究人员开发了miR-34a的完全修饰版本(FM-miR-34a)。他们的研究表明，FM-miR-34a比部分修饰的版本稳定几个数量级，而不影响其活性，对更多miR-34a靶点呈现更强抑制。FM-miR-34a有效抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，并诱导内源性靶基因在体内传递后持续下调>120小时。通过将FM-miR-34a偶联叶酸(FM-FolamiR-34a)可实现体内靶向，能够抑制肿瘤生长，从而在小鼠中完全治愈肿瘤。这些结果有望重振miR-34a作为抗癌药物的希望，为临床试验提供了强有力的理论依据。

小分子RNA修饰

已有几种化学修饰用于稳定RNA，包括对核糖的2'-o-甲基和2'-氟修饰，以及对主链的硫代取代。核糖修饰可提高结合亲和力，保护其免受核酸酶降解，而硫代酸键可提高其对外切酶的额外抗性。2'-o-甲基修饰还有助于避免引发免疫系统刺激。不过，过多的修饰可能会改变靶基因亲和力、增加miRNA双链的稳定性而影响miRNA的沉默活性。因此，精心设计和选择一种恰到好处的修饰模式很重要，既要能增强miRNA稳定性，同时又要适合RISC加载和对靶基因抑制。

作者团队设计了一种完全修饰的miR-34a (FM-)，其不对称模式包含一条22核苷酸的引导链，一条15核苷酸的互补链，这降低了两条链之间的热动力学，促进了RNA诱导沉默复合物(RISC)的链位移，这是一种用于稳定siRNA的类似模式。每条链含有2'-o-甲基和2'-氟修饰的核糖和每条链3 '和5 '端磷酸化键的交替模式，以降低免疫原性并提供外切酶抗性(图1A, B)。PM-miR-34a和FM-miR-34a双链被生成并确认。在50%的血清中孵育一段时间后，将FM-miR-34a的稳定性与PM-miR-34a和未修饰的miR-34a双链物的稳定性进行比较。FM-miR-34a在24小时内完全耐受，并保持完整至少72小时。研究人员再通过实验分别证实了以下4点：

1. FM-miR-34a的各种化学修饰不会干扰miR-34a的沉默活性；

2. FM-miR-34a转染的细胞中的转录本在表达上的改变往往更明显；

3. FM-miR-34a在体外抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭

4. FM-miR-34a活性依赖于加载到Argonaute (Ago)

示意图来自作者原文

递送方式

还有一样同样重要的，是在没有毒性的情况下实现对肿瘤组织的特异性靶向。目前实现这一目标的方法包括使用配体递送RNA——将RNA偶联到靶配体上，该配体对靶细胞上调的受体具有高亲和力和特异性。由于许多肿瘤上调细胞表面受体，如果将能与这些上调受体结合的配体设计成携带抗肿瘤弹头，可以将药物特异性地靶向肿瘤细胞。一种受体要想用于药物输送，其靶受体必须满足两个标准:相对于正常细胞，它必须在癌细胞上过度表达，并且表达水平必须足以实现治疗量的输送。叶酸受体(FR)在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和其他癌症中过度表达，满足这两个标准。

在临床上推进FM-miR-34a，需要一种特异性、操作耐受性好和无毒的递送平台。作者使用了叶酸-miRNA递送策略，能将miRNA特异性递送到过表达叶酸受体(FR)的肿瘤中，而无需将miRNA包装在载体中。在这种情况下，裸miRNA受到血清和细胞核酸酶的双重作用，从而全面评估完全修饰的miRNA在临床环境中的表现。

FM-FolamiR-34a在体内的活性评价

首先，作者验证了叶酸偶联物能够稳健且特异性地递送到FR表达细胞中。然后，将FM-miR-34a与叶酸偶联，生成FM-FolamiR-34a双链。携带MB-231荷瘤小鼠被注射单次1.5 nmol剂量的FM-FolamiR-34a或对照。接受单剂量FM-FolamiR-34a治疗的动物中，报告信号在全身注射24小时后被显著下调，并且至少在96小时内保持抑制状态。

在120h的活体成像时间点之后，收集肿瘤并评估miR-34a的内源性靶点。单次1.5 nmol剂量的FM-FolamiR-34a处理后5天，靶基因明显下调。MET和AXL在所有三种肿瘤中均未检测到，而CD44水平显著降低，证实了FM-miR-34a在体内有效沉默其生物靶点的能力。强大和持续的靶向可能是靶标和FM-miR-34a之间热稳定性增加的贡献，加上FM-miR-34a的稳定性增加，这一点突出体现在FM-FolamiR-34a处理的小鼠中收集的肿瘤中miR-34a拷贝数比对照小鼠增加了>1.5倍。

基于其突出的持续靶向性，对MB-231荷瘤小鼠进行了多剂量疗效研究。每6天通过尾静脉给予1.5 nmol的叶酸缀合物。该特定剂量和给药频率的合理依据是单剂量实验，注射后至少5天靶基因被显著抑制。FM-FolamiR-34a对肿瘤生长的抑制作用更强，产生了明显的肿瘤静态效应。值得一提的是，在21天给药期结束时，两只给药的小鼠的肿瘤缩小到初始体积的45-75%，其中一只完全治愈。而在整个研究过程中，没有观察到体重的显著变化，表明FM-FolamiR-34a的安全性。为了初步评估潜在的免疫应答，他们将FM-FolamiR-34a注射到免疫功能正常的FVB.129小鼠的尾静脉，并在注射后2小时定量血清中IL-6和TNF-α的水平。FM-FolamiR-34a未引起细胞因子水平明显高于阴性对照，而阳性对照LPS引起细胞因子水平明显升高。总之，这些结果表明，FM-FolamiR-34a在体内诱导miR-34a的合成靶点和生物学靶点更强、更持久的沉默，从而导致肿瘤生长的显著延迟。

这种分子的作用“就像汽车上的刹车”，减缓或停止细胞分裂。除了减缓或逆转肿瘤生长外，靶向microRNA-34a还强烈抑制了至少三种基因(MET、CD44和AXL)的活性，这些基因已知会导致癌症和对其他癌症治疗的耐药性，持续时间至少为120小时。研究结果表明，这种疗法是15年来针对microRNA摧毁癌症的最新研究成果，它可以单独有效，也可以与现有药物联合使用，用于治疗已经形成耐药性的癌症。

“当我们获得数据时，我欣喜若狂。我相信这种方法比目前的标准治疗要好，而且会有患者从中受益，”普渡大学癌症研究所的成员Kasinski说。