王应祥组揭示真核生物减数分裂特异重组酶DMC1的泛素化及降解机制

　　

 2023年8月19日，王应祥课题组在Nature Communications在线发表了题为“SCF^RMF mediates degradation of the meiosis-specific recombinase DMC1”的研究论文（https://www.nature.com/articles/s41467-023-40799-5）。该研究首次在真核生物中揭示了减数分裂特异重组酶DMC1受到泛素化修饰并通过蛋白酶体降解的分子机制，并证实了DMC1的稳态维持是保证同源染色体发生重组和交换的基础。

减数分裂是真核生物有性生殖产生单倍体配子（精子或卵子）所必需的细胞分裂形式，经过一次DNA复制及两次细胞核分裂，产生染色体数目减半的配子，雌雄配子融合后染色体数目又恢复正常，从而保证了遗传物质的稳定性。减数分裂过程中同源染色体间的重组既确保了同源染色体间遗传信息发生交换，又促进了种群的演化和生物多样性的形成。减数分裂重组起始于SPO11介导的程序性DNA双链断裂（Double-strand breaks，DSBs），并依赖于进化上高度保守的RecA类重组酶DMC1和RAD51对其进行修复，随后二者从染色体上解离下来，从而使后随的重组因子能够结合至染色体上，最终产生交换（Crossover，CO）或非交换（Non-crossover，NCO）。其中，DMC1为真核生物中高度保守的减数分裂特异重组酶，倾向于选择同源染色体为修复模板。多个物种中的研究表明，DMC1是减数分裂中的主效重组酶，而RAD51发挥辅助功能。从1992年发现至今30余年，对于DMC1的研究集中于其调控减数分裂重组的作用机制，而对其蛋白质的修饰和降解机制尚不清楚。

本研究利用质谱鉴定并结合生化实验发现拟南芥减数分裂特异重组酶DMC1能够发生泛素化修饰并通过26S蛋白酶体降解，并进一步鉴定到一对减数分裂功能冗余的F-box蛋白RMF1（Reduced Male Fertility 1）和RMF2 （Reduced Male Fertility 2），rmf1和rmf2单突变体生长发育未见异常，而双突变体rmf1 rmf2表现类似于dmc1的减数分裂重组异常。体内体外实验证明RMF1/2通过其N端的F-box结构域与E3复合体SCF的ASK1亚基相互作用；遗传分析表明RMF1/2与ASK1特异地参与 DMC1介导的减数分裂重组通路。进一步研究证实RMF1/2通过其C端结构域与DMC1的C端相互作用，暗示RMF1/2作为SCF^RMF1/2复合体的F-box亚基参与DMC1的调控。通过泛素化及蛋白质降解实验证实，RMF1/2介导DMC1的泛素化并促进其通过26S蛋白酶体降解。利用质谱鉴定到DMC1的潜在泛素化位点（赖氨酸残基，K），并将K突变为不能发生泛素化的精氨酸（R），构建了相应的DMC1-6KR变体。通过AlphaFold预测，DMC1-6KR的蛋白质结构没有发生变化；植物体内实验及生化实验证实，DMC1-6KR的亚细胞定位不受影响，并且同样能够与RMF1/2相互作用，但其泛素化水平及降解水平均显著低于DMC1，暗示这些位点对于DMC1泛素化及降解的重要性。为了进一步验证DMC1泛素化对减数分裂重组的影响，本项目将DMC1全长基因组（DMC1g）及变体DMC1-6KR全长基因组（DMC1g-6KR）转回至dmc1突变体中，发现DMC1g可以完全恢复dmc1突变体的减数分裂异常表型；而DMC1g-6KR/dmc1中DMC1的蛋白质水平显著高于DMC1g/dmc1，但无法恢复dmc1突变体的减数分裂重组异常。进一步证实了以上位点对于DMC1泛素化的重要性，并暗示DMC1泛素化及其蛋白质水平对于减数分裂重组至关重要。

综上所述，本研究首次在鉴定到了减数分裂功能性F-box蛋白RMF1/2，揭示了RMF1/2介导DMC1的泛素化并通过26S蛋白酶体降解的分子机制。由于减数分裂重组和重组酶DMC1在真核生物中的高度保守性，我们推测本研究发现的DMC1泛素化调控和降解机制在真核生物中也相对保守。同时也证实了DMC1的稳态维持机制是保证减数分裂重组顺利进行的基础。研究结果不仅丰富了减数分裂重组的分子机制，还为作物遗传育种及人类生殖健康提供了理论基础。

复旦大学生命科学学院博士生徐婉约为文章第一作者，复旦大学/华南农业大学/岭南现代农业生物与技术广东省实验室王应祥教授为通讯作者。复旦大学张旭敏研究员，华南农业大学尤辰江教授，美国宾夕法尼亚大学生物系马红教授，美国北卡罗来纳大学教堂山分校Gregory Copenhaver教授和中国农业大学贺岩教授提供了指导和帮助，复旦大学博士生余悦、吴真博士和中国农业大学/德国马克斯-普朗克研究所景居里博士也参与了该项工作。相关工作得到了国家自然科学基金和复旦大学遗传工程国家重点实验室的资助。