质疑一篇《Nature》中描写的NLGN2在星形胶质细胞中的作用

但多位独立研究人员表示，他们并不相信这一结果，因为它未能证实2017年备受瞩目的发现。

　　

一项新的预印本声称，从小鼠的星形胶质细胞中删除一种叫做神经胶质素的粘性分子对细胞的形状或突触的形成没有影响。这些发现与2017年发表在《Nature》杂志上的一篇备受瞩目的论文不一致。但2017年的研究小组（Cagla Eroglu等人）以及没有参与这两项研究的研究人员表示，除了其他缺点外，这项新工作还没有定论，因为它没有充分证明神经球蛋白被删除了。

瑞士巴塞尔大学生物中心的细胞和发育神经生物学教授Peter Scheiffele没有参与这两项研究，他说:“一般情况下，很难令人信服地证明某些东西没有发挥作用，因为这真的关键取决于你百分之百地确定你已经完全消除了蛋白质水平上的基因产物。要真正确信你已经成功切除了目标基因，举证的责任非常大。”

神经素(NLGNs)在神经元表面大量表达，在那里它们将突触连接在一起，并且它们与自闭症有关。

2017年（Cagla Eroglu等人）的研究表明，星形胶质细胞表达NLGN1、NLGN2和NLGN3。根据这项研究，通过RNA技术部分抑制它们会阻碍星形胶质细胞在培养中的生长，并改变它们标志性的星形形状。一些星形胶质细胞缺失NLGN2的小鼠在视觉皮层星形胶质细胞周围形成的兴奋性突触较少。当NLGN2从小鼠大约一半的星形胶质细胞中删除时，神经元兴奋度下降了约25%。

2017年的结果“似乎通过识别一种似乎对突触形成至关重要的分子，验证了星形胶质细胞是突触形成的重要组成部分的观点，”加州斯坦福大学分子和细胞生理学和神经外科教授Thomas Südhof说，他领导了这项新的预印，但没有参与2017年的工作。这一发现引起了Südhof的怀疑，因为NLGN2以前只在抑制性突触中被发现。因此，他开始通过从小鼠的星形胶质细胞中完全删除NLGN1、NLGN2和NLGN3来验证这一发现。新的预印本推导2017年研究无效的原因，不太可能像Scheiffele和其他人建议的那样，用神经球蛋白的不完全删除来解释。“基因缺失是生物学的黄金标准，这就是我所说的‘最后一口气’，用来解释人们情愿看到的、可能性很小的结论。”

预印本的结果不排除星形胶质细胞神经球蛋白可能对突触功能有一定影响的可能性。“我们在论文中唯一的主张是，我们测试了星形胶质细胞中的神经胶质素是否对兴奋性突触或抑制性突触至关重要，”                 Südhof说。“我们的结论是，‘它们不是’。”他和他的同事们于4月在bioRxiv上发表了他们的预印本，并于6月23日在eLife上发表了经过审查的预印本。根据其中一位匿名的公众评论，预印本是“一篇非常清晰有力的论文，有严格的实验支持。”

辩白

一篇匿名评论指出，新研究没有提供直接证据，证明所有三种神经胶质素都被有效地从星形胶质细胞中删除了，这使得该研究“有点容易受到批评，尽管这种批评不太可能，即它们缺乏突触效应可能是神经胶质素不完全删除的结果，而不是星形胶质细胞神经胶质素真正缺乏作用。”

截至本文发表之日，两边的审稿人都没有回应Spectrum的置评请求。2017年这项研究的作者拒绝通过电话讨论此事，他们更愿意通过电子邮件回答问题。

首席研究员、北卡罗来纳州达勒姆杜克大学细胞生物学和神经生物学教授Cagla Eroglu在给Spectrum的一封电子邮件中写道，新的预印本并不像它声称的那样具有决定性。Eroglu说，原因与所涉及的基因技术有关——根据预印本，Südhof研究小组在用一种叫做他莫昔芬的药物治疗小鼠时，对小鼠进行了培育，使其感兴趣的神经素可以被一种叫做re-重组酶的酶删除。在另一项单独的实验中，Südhof的团队将同样的Cre小鼠与经过基因改造后表达一种红色蛋白质tTomato小鼠进行杂交，其中Cre是活跃的。预印本显示，在第二次实验中，红色蛋白出现在海马体中超过80%的星形胶质细胞中，约90%出现在视觉皮层中，这表明在基因敲除实验中，有问题的神经素将以相同的效率被清除。

而Eroglu的团队使用了类似的基于cre的技术，在表达相同红色报告蛋白的小鼠中删除了NLGN2。但她的团队采取了额外的步骤来验证NLGN2的抑制，她在电子邮件中写道:NLGN2 RNA水平在大约50%的星形胶质细胞中显著下降，但不是完全下降。

挑剔的看客

没有参与任何研究的德国萨尔大学(University of Saarland)分子生理学教授Frank Kirchhoff认为:“一切都归结为‘请告诉我星形胶质细胞的细胞表面有多少蛋白质，这些蛋白质是否被移除了?’”

Scheiffele和Kirchhoff也说，Eroglu 2017年的研究和Südhof2017的预印本都有一个弱点:都没有研究神经球蛋白在星形胶质细胞中的物理存在。Kirchhoff说:“对我来说，如果没有直接显示蛋白质水平的变化——单细胞水平的蛋白质变化——就很难真正掌握所有的数据。我认为两者都必须用免疫球蛋白染色的电子显微镜来显示蛋白质在星形胶质细胞表面的表达。”

Südhof团队也应该以某种方式证实他们的三重缺失。“众所周知，不同的基因座以不同的速度重组，打开一个标记并不意味着你真的会敲除感兴趣的基因，”Scheiffele说。最重要的是，“结合的等位基因越多，单个等位基因的消融效率就越低。”这是因为鼠有两个NLGN1和NLGN2的拷贝(雌鼠也有两个NLGN3的拷贝，而雄鼠只有一个拷贝)。Scheiffele估计，在最好的情况下，假设所有等位基因的重组效率与表达tTomato报告基因的效率相同，达到80%，那么在雄性小鼠中，删除这三个基因的所有副本的几率约为1 / 3，在雌性小鼠中为1 / 4。

tTomato报告基因的水平仅表明Cre在特定细胞类型中作用于DNA的可能性有多大。

缅因州巴尔港的杰克逊实验室(Jackson Laboratory)负责操作效率和平台开发的副主任Bill Buaas说，这并不能保证1个或3个目标基因会在任何给定的细胞中被删除。由于NLGN基因有两个等位基因，“为了让它们在这些基因中失去功能，它们必须在同一个细胞中获得两个拷贝，”Buaas补充道。“这是一个更高的要求。你真正想做的是说:(星形胶质细胞)是否缺少我感兴趣的蛋白质?这是一组重要的实验。”Scheiffele和其他一些人同意这一观点，他们说，核查将会很困难，但并非不可能。

由于这些原因Südhof的研究小组需要使用抗体来验证神经球蛋白的缺失，这种抗体会附着在蛋白质上，如果它们存在，就会对它们进行染色。

批驳

Südhof不同意这一观点，他说用Buaas和Kirchhoff建议的方法测量星形胶质细胞中的神经球蛋白在技术上是不可能的。他坚持认为他的团队的技术是可靠的。Südhof说:“我们之前已经证明，这三种神经胶质素基因可以通过Cre重组酶有效地重组，并且删除过程中没有不完整性。”他指的是他和同事在2015年和2017年的一篇论文中从神经元中删除了三种神经胶质素。  

但是不同的细胞特异性Cre小鼠品系“从效率的角度来看，表现完全不同，”Buaas说。“你不能假设它们会以相同的频率删除。在2017年的论文中，研究小组直接用Cre感染小鼠，而不是将它们与Cre小鼠株杂交。“这就像拿苹果和橘子做比较，”Buaas说。“预印本如果试图证明‘无效’，那么验证删除已经发生就变得更加重要。我认为，如果你真的对科学过程有纪律，那么从没有效果得出结论是极其危险的。”

相反，Eroglu解释说，她的团队2017年的论文显示，NLGN2蛋白在小鼠的星形胶质细胞中表达，这是基于使用免疫球蛋白染色的共聚焦显微镜的实验。“用于染色的神经素抗体很差。因此，我们正在开发其他方法来检测这些蛋白质，”她在电子邮件中写道。她仍然坚定地认为星形胶质细胞神经球蛋白值得这个领域的关注。“我们正在深入研究星形细胞神经球蛋白的功能，”她写道。“其中一些研究即将完成，我们期待着很快分享我们令人兴奋的新发现。”