直接测量血液中病毒载量的数字测试

宾州大学公园-一毫升血液含有大约15滴血液。对于患有人类免疫缺陷病毒(HIV)的人来说，每一滴血中可能含有的病毒拷贝从不到20个到超过50万个不等。这被称为病毒载量，是用来让临床医生了解患者对抗病毒药物的反应和监测潜在进展的。

耗时的病毒载量检测需要在患者接受治疗时重复多次。现在，宾夕法尼亚州立大学的一个研究小组已经开发出一种既省时又经济的数字检测方法，可以直接测量一滴血中HIV的存在。他们在ACS Nano上发表了这项研究。

根据通讯作者、宾夕法尼亚州立工程学院电子工程和生物医学工程副教授Weihua Guan的说法，数字检测是为一系列传染病提供临床诊断工具的第一步。

艾滋病毒载量的常规检测包括从样本中提取遗传物质，将其放大并与参考样本进行比较。被称为RT-PCR的金标准测试，可以对实际病毒载量做出接近的估计，但它不是直接测量。Guan和他的团队在他们的测试中采用了更直接的方法，名为通过自动膜基分割(STAMP)进行自我数字化，与RT-PCR相比，这种方法更便宜、更快，需要的血液也更少。

“这是它的工作原理:我们从一个人的血液中提取一小部分样本，从中提取病毒RNA——病毒的遗传物质，”Weihua Guan说。“然后我们将这种RNA与一种叫做Cas13的特殊蛋白质混合，Cas13是CRISPR系统的一部分。”

CRISPR-Cas13是一种“革命性的工具”，它使研究人员能够瞄准和操纵RNA序列。在这项研究中，研究人员利用这项技术不是为了它的编辑能力，而是为了它的诊断潜力。

一旦RNA与Cas13结合，研究人员在混合物上放置一层纳米孔聚碳酸酯膜——一种很容易获得的薄过滤器，使其成为一种经济有效的材料。纳米孔是如此之小，以至于它们可以将混合物分割成只含有一个RNA分子的单个液滴，这个RNA分子附着着Cas13蛋白。如果HIV在RNA分子中，Cas13蛋白——被HIV RNA激活——将切断报告的分子，产生一个科学家可以检测到的信号。

“通过计算显示这种信号的液滴的数量，我们可以确定人血液中的艾滋病毒数量，”Weihua Guan说。“带有信号的液滴越多，病毒载量就越高。”

在测试实验室血浆和最终患者血浆样本之前，研究人员用合成HIV RNA测试了这种方法，以优化分析的灵敏度和准确性。他们通过定量20例患者血浆样本中的HIV病毒载量来验证STAMP方法，其准确性与传统的RT-PCR方法相当，后者通常需要更多的血液。他们正在努力获取更多的样本来继续他们的测试。

该研究小组还发现，这种方法可以对每毫升血液中超过2000个病毒拷贝的HIV病毒载量进行准确评估。当每毫升病毒拷贝数少于1万个时，就认为病毒载量低;在20份或更少拷贝时无法检测;大约10万份，但也可能超过100万份。

据Weihua Guan说，2000到10000的检测范围对于临床医生监测患者的病毒反弹可能很重要。接受抗逆转录病毒治疗(ART)的人可以达到无法检测到的病毒水平，这意味着他们不能再通过性行为传播病毒，但病毒水平上升可能表明一个人正在产生抗逆转录病毒治疗耐药性或其他问题。

Guan说:“虽然需要进一步改进以提高其检测极限和自动化设置，但基于stamp的数字CRISPR方法显示出推进HIV病毒载量监测的巨大潜力。”他解释说，研究人员计划继续提高平台的效率和准确性，以量化多种病毒，最终目标是将该设备推向市场。

STAMP-Based Digital CRISPR-Cas13a for Amplification-Free Quantification of HIV-1 Plasma Viral Loads