用户成果 | 双光镊系统在单分子蛋白质折叠方面的应用

　　

双光镊系统在单分子蛋白质折叠方面的应用

        2023年2月7日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心刘珈泉及其合作团队在单分子蛋白质折叠方面取得重要进展，该工作利用国家蛋白质科学研究（上海）设施高分辨率双光镊系统揭示了在小分子蛋白Complexin-1（CpxI）调节下可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体（Synaptic-soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment REceptor ，SNARE）复合物的动态组装机制。通过双光镊对系留的蛋白质复合物施加微小的力，研究SNARE复合物在CpxI调节下的折叠动力学，确定了CpxI片段结合在SNARE复合物上不同位点的相互作用机制。

        神经递质释放和细胞间通讯需要膜融合，神经元SNARE复合物为关键的融合蛋白，包括三种单体蛋白：合成蛋白，SNAP-25（突触体相关蛋白，大小为25 kDa）和VAMP（囊泡相关膜蛋白）。当前，SNARE复合物功能在单分子水平上尚未得到很好的理解，比如动态SNARE组装如何受到CpxI蛋白的调节。

        本研究中，双光镊分别捕获一个微米级高分子微球，通过双链DNA手柄将SNARE蛋白质复合物连接在两个微球上，进而可以通过光镊对SNARE蛋白质复合物精确地施加作用力（图1a）。当蛋白质复合物所受的力增大时，会引起末端距的增加，进而绘制单分子的力随伸长量的变化曲线（图1b）。

        当光镊施加的力在7~13 pN 时，SNARE 复合物连接域从完全折叠态打开。当力提高到 17~19 pN 时，SNARE 复合物在 C 端缓慢去组装。随后继续增加力，出现一个约5 nm 的断裂信号，对应没有二硫键连接的单体蛋白 SNAP-25 的不可逆解离。通过力-伸长曲线可以判断在多大力作用下，蛋白质会发生构象变化，再采用光镊施加一个恒定的力研究蛋白质折叠动力学（图1c）。

图1: a. 单分子双光镊的“哑铃”构型。b. 拉伸(黑色)和放松(灰色)过程中单个SNARE 复合物的力-伸长曲线。c. 恒定光阱距离下单个蛋白复合体的伸长演化曲线，以及各态所对应的构象。

 

        为了研究CpxI对SNARE蛋白复合物动态组装的作用机理，在单个SNARE复合物维持在动态组装过程中，通入全长CpxI，发现SNARE复合物的组装和去组装过程呈现出C端阻断态（C-terminal blocked state）、中间钳制态（Middle-clamped state）及C端稳定状态（C-terminal stabilizaed state）三类信号（图2a）。图2b插图给出了CpxI与SNARE相互作用的模型。

图2：CpxI稳定了部分折叠的SNARE复合物。a. 在CpxI存在下，在保持光镊距离恒定时，单个SNARE复合物的伸长随时间变化曲线。b. 蓝色虚线框内信号放大图。插图为结合CpxI的不同SNARE复合物状态。c. 有CpxI（红圆）和无CpxI（黑三角形）时伸长量的概率分布及高斯拟合(红线和黑线)。

 

        对C端阻断态信号， SNARE 复合物由原来的2-5态均有分布，到加入 CpxI 后第 2 态消失。图3c中对单个SNARE复合物在恒定光阱距离模式下伸长量的高斯拟合证实了加入CpxI后第2态分布减少，4、5态分布增加。证明全长 CpxI 将SNARE复合物锁定到 C 端组装被抑制状态，对应生理状态下 CpxI 的“钳制”功能。在C端稳定状态信号中，加入CpxI后，SNARE 复合物由2-5态均有分布变成了主要分布在第2态，即SNARE复合物保持在Linker 结构域打开的四螺旋束状态，这表明 CpxI有稳定四螺旋 SNARE 复合物的能力。对应在生理状态时，CpxI在触发信号钙离子到达后将 SNARE 复合体稳定在完全折叠态，有助于实现神经递质的全部释放，即“促进”的功能。中间钳制态则是SNARE 复合物由原来的 2-5 态均有分布变成了只有3-4 态，此时CpxI各个结构域相互协作，既稳定了 SNARE 复合体的 N 端，同时抑制了四螺旋束的 C 端组装, 对应生理状态下 CpxI 的“钳制”功能。

        光镊实验为从单分子层次理解CpxI不同肽段在与SNARE复合物作用发挥着不同的功能。进一步通过对 CpxI的不同截短体进行光镊实验，发现CpxI的NTD（AH-CH肽段，1-83aa）将SNARE复合物稳定在第2态，这表明CpxI的1-83aa稳定了SNARE复合物的四螺旋束，能很好实现“促进”功能。其中NTD（1-26aa）在“促进”功能中有主导作用。CTD（83-134aa）则是实现“钳制”功能的关键结构域，并且将 CTD 与 NTD（AH-CH，1-83aa) 肽段混合加入时，也可以实现与全长CpxI同样的功能。利用双光镊有效地测量野生型和突变型/截短型CpxI如何影响SNARE复合物的折叠动力学，在单分子水平证实了CpxI不同结构域在SNARE动态组装中的功能。

 

设施贡献

        国家蛋白质科学研究（上海）设施自2012年开始自主研制高精度的激光光镊系统，并于2015年通过国家发改委组织的设施验收。设施所研发激光光镊为采用差分探测的双光镊（图3），作为大科学装置的核心研制仪器，它可以操控和追踪微球并测量记录两个微球间的作用力与位置等信息，主要用于研究蛋白质的折叠、RNA聚合酶相互作用等生物大分子的机械力学特性和动力学机理。该系统通过建立恒温恒湿的光学实验室以及双光镊差分探测系统，结合多通道样品池有效地在两个微球之间连接单个生物大分子，实现对微纳米颗粒位置及力学信号的长时间高精度测量。

图3: 双光镊系统的光路（a）与实物图（b）。

        本研究中，国家蛋白质科学研究（上海）设施分子影像系统负责高精度激光双光镊的研制，在样品制备、单分子实验、数据收集方面为该工作提供了强有力的技术支持及机时保障。复合激光显微镜系统参与早期设备研制，并为分子影像系统运行提供有力保证。

        目前，单分子光镊技术在应用方面仍有非常大的发展空间，其应用范围也正不断拓宽。蛋白质设施自主研制专门用于单分子实验的光镊仪器对国内高端科研仪器的研发具有重要的推动作用和借鉴意义。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s42003-023-04506-w