通过超声波来监控基因表达——全新的声学报告基因

一提到报告基因，大家的脑海中最先闪现的也许是荧光报告基因。它们被广泛应用于基因表达研究，但也存在一些限制，比如无法应用于深层组织，因为光很容易被组织散射。于是，加州理工学院的Mikhail G. Shapiro实验室在2018年开发出声学报告基因（Acoustic Reporter Genes，简称ARG）。

这组基因的表达能够在细胞中产生一种独特的充满空气的蛋白质纳米结构，也就是气体囊泡（gas vesicles）。这些囊泡原本存在于水生的光合生物中，作为调节浮力的一种手段。在使用超声波成像时，这些产生气体囊泡的细胞会发出声音信号，从而实现可视化。

由于超声波是一种广泛使用的成像方式，具有良好的组织穿透深度以及高的时空分辨率，因此声学报告基因也成为体内基因表达可视化的理想选择。

ARG在细菌中的表达

第一代细菌ARG（bARG）在体温（37℃）下表达不佳，而且原位表达负担太重。因此，它们必须先在体外表达，然后注射到细菌中，这限制了它们的使用。于是，Shapiro实验室的研究人员着手开发新一代的bARG。

他们从一组表达气体囊泡的物种中筛选了相关基因，发现来自沙雷氏菌（Serratia sp. 39006）的气体囊泡基因在大肠杆菌中产生了最高水平的非线性超声造影。于是，他们采用了这个基因bARGSer，并使用了阿拉伯糖诱导型启动子pBAD。同时，他们还添加了毒素/抗毒素稳定元件Axe-Txe，最终形成了质粒pBAD-bARGSer-AxeTxe。

有了这种新质粒，就很容易实现气体囊泡在大肠杆菌中的表达。在37℃培养细菌12小时，用阿拉伯糖诱导的培养物以及阿拉伯糖平板上的菌落会明显变白，在相差显微镜或电子显微镜下都可以观察到细胞中的气体囊泡。

若想在体内表达气体囊泡，也很简单。当大肠杆菌在肿瘤上定植后，通过腹腔注射L-阿拉伯糖，等待24小时后采用超声波成像。在细菌定植的地方，您可以观察到气体囊泡特异性的超声波造影。

ARG在哺乳动物细胞中的表达

第一代的哺乳动物ARG（mARG）能够对深层组织中哺乳动物基因的原位表达进行超声可视化。不过，这些气体囊泡的表达和声学特性较差，难以在组织中实现非破坏性的成像。而且，mARG载体太大，表达存在细胞异质性。

因此，研究人员希望构建第二代mARG，表达量更高，体积更小，可实现非线性声散射。他们发现，水华鱼腥藻（Anabaena flos-aquae）的气体囊泡基因簇是最佳候选。

第二代的mARG由两个PiggyBac可整合表达框组成，都带有强力霉素（doxycycline）诱导的启动子（下图）。第一个表达框包含主要的结构基因gvpA，第二个表达框包含与P2A相连的附属基因gvpNJKFGWV。这个被称为mARG_Ana的质粒系统可直接用于瞬时转染，也可与表达PiggyBac转座酶的质粒共转染而整合到基因组中。

在诱导表达仅一天后，通过超声波成像和相位对比显微镜就可以检测到气体囊泡。不过，更长时间的表达会带来更多的气体囊泡，并增加超声对比。研究人员发现，在测试的所有细胞系中，1 μg/mL的强力霉素足以使表达饱和。

建立细胞系是一项耗时耗力的工作，因此，研究人员还构建了一套由CMV启动子驱动的组成型表达的mARG质粒。他们建议刚刚接触mARG表达的实验室首先尝试用最可靠的方法生产气体囊泡，也就是用化学转染试剂（比如PEI-MAX）将mARG质粒转染到HEK293T细胞中。

只需将1248 ng CMV-gvpA-IRES-BFP质粒和954 ng CMV-gvpNJKFGWV质粒的混合物共转染到汇合度为70%的HEK293T细胞，从转染后第2天开始，在相位对比显微镜下就能观察到气体囊泡。

如果大家对声控基因表达感兴趣，可以在Addgene网站上寻找ARG相关质粒。

参考文献

Hurt, R.C., Buss, M.T., Duan, M. et al. Genomically mined acoustic reporter genes for real-time in vivo monitoring of tumors and tumor-homing bacteria. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01581-y