一招分辨磷酸化蛋白or总蛋白----LI-COR Odyssey帮您来实现

【字体：大中小】 时间：2023年05月12日 来源：

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　　文中作者使用不同荧光基团标记的二抗，同时检测了磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平，无需进行剥离及再孵育，大大缩短了磷酸化蛋白检测的时间，实现了高效便捷的磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平检测。

什么是蛋白质磷酸化？

蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上，使蛋白质构象发生改变，产生活性进而行使功能的过程。而磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下又可以去磷酸化，整个过程是可逆的。

蛋白质磷酸化有什么用？

蛋白质的磷酸化和去磷酸化是可逆性调节蛋白质功能的重要方式，几乎涉及所有生理、病理过程，如细胞的生长发育、基因表达与调控、神经递质的合成与释放，甚至细胞癌变等。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，细胞控制着信号的传递过程，进而影响细胞的生物学效应与功能，在生命活动中发挥着重要作用。

蛋白质磷酸化如何检测？

在进行蛋白质磷酸化Western Blot分析检测时，需要同时检测磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平，但两者分子量差距很小，使用化学发光方法进行检测时，需要先使用磷酸化蛋白抗体进行孵育、检测，之后进行剥离，再重新孵育该蛋白的抗体进行检测。

既然化学发光Western Blot检测法检测磷酸化蛋白这么麻烦，那有没有什么方法可以实现磷酸化蛋白快速便捷的检测呢？

作者Xiomaris M. Cotto-Rios等利用LI-COR Odyssey 进行Western Blot，检测了目的蛋白（抗原/抗体）是否表达、表达的特异性、表达量的高低。文中作者使用不同荧光基团标记的二抗，同时检测了磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平，无需进行剥离及再孵育，大大缩短了磷酸化蛋白检测的时间，实现了高效便捷的磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平检测。由于药物筛选实验的高通量性，本文还用到了LI-COR In cell western（无需裂解细胞、制胶、上样、跑胶、转膜等步骤，直接在96孔/384孔板进行点Western Blot），进行高通量的Western Blot蛋白定性定量分析。

In-cell western 技术优势

1、省时，直接在微孔板检测，无需细胞裂解、跑胶和转膜等过程；

2、高通量，一次可实现6*96/384个样品检测；

3、数据变异小，直接对细胞内的蛋白进行检测，特异性好，灵敏度高；

4、双通道同时检测，不同荧光标记二抗同时检测两个蛋白

文章研究背景

BRAF激酶是众所周知的ERK信号通路的关键效应因子，在许多癌症中被过度激活。然而在许多肿瘤中，BRAF二聚体也会介导ERK信号传导。因此有些FDA批准的RAF抑制剂对BRAF二聚体的抑制效果不佳，从而也会导致肿瘤的耐药性。Ponatinib（普纳替尼）是FDA批准的药物，是BRAF单体和二聚体的有效抑制剂，Ponatinib可结合BRAF二聚体，并通过与先前未发现的变构位点相互作用来稳定一个独特的αC-螺旋构象。基于上述已在结构方面取得的研究成果，接下来要介绍的这篇文章，作者研究开发了一种新的BRAF抑制剂—PHI1，与Ponatinib都将更有助于对BRAF依赖性肿瘤的治疗。

部分数据展示

RAF二聚体激酶抑制剂的筛选

首先为了实现对RAF二聚体激酶抑制剂的鉴定，作者使用SKMEL239-C4黑素瘤细胞建立了基于In cell western筛选的测定方法（见下图a、b）。在 Vemurafenib（维莫非尼，BRAF选择性抑制剂）诱导的抑制BRAF的选择压力下，允许表达p61BRAF（p61BRAF对Vemurafenib病毒有抗药性，可在患者的肿瘤中发现）的细胞优先生长，即这类细胞可产生BRAF的剪接突变体，其以不依赖于RAS的方式通过二聚体形式进行信号通路转导。对未经药物处理或用增加浓度的 Vemurafenib处理过3小时的SKMEL239-C4细胞，测定其细胞内的蛋白磷酸化水平。微孔板的In cell western图像显示的是细胞中磷酸化ERK1(绿色)和总ERK1(红色)的荧光抗体孵育后的表达情况及其合并图像(图2c)。基于磷酸化ERK (p-ERK)和总ERK荧光读数的 In cell western ，检测到的信号动态范围广泛，并且在低浓度的 Vemurafenib下重现了SKMEL239-C4细胞的p-ERK 抗性。相反，Trametinib，一种FDA批准的MEK抑制剂，在低nM浓度下有效地抑制ERK信号传导(图2e)。作者使用具有非抑制浓度的Vemurafenib作为阴性对照和0.1μM Trametinib阳性对照的96孔格式，获得0.68的Z因子(图2f)。作者发现，Ponatinib是一种有效的BRAF抑制剂，具有与其他RAF抑制剂相似的效力。

Ponatinib能有效抑制致癌性BRAF

接下来，检测Ponatinib依赖于BRAFV600E，p61BRAFV600E和 RASMUT/BRAFWT的ERK信号传导抑制肿瘤细胞的能力。为了与BRAFV600E单体的有效抑制剂进行比较，作者使用了Vemurafenib。Ponatinib在0.3-0.5μM的剂量下抑制BRAFV600E和p61BRAFV600E依赖性黑素瘤细胞中的ERK信号传导。然而，需1-3μM的剂量才能有效抑制RASMUT/BRAFWT黑素瘤或肺癌细胞中的信号传导，这表明由于RAF引发的一些抗性与其他αC-IN 抑制剂类似(图3a)。

Ponatinib抑制ERK信号传导而不降低SKBR3细胞中的RASWT-GST水平，而Lapatinib抑制ERK信号传导并如预期的那样显著降低RASWT-GST水平(图3b)。

用设计的抑制剂开发BRAF变构部位

基于对Ponatib-BRAF^V600E 二聚体结构的认识，进一步开发已鉴定的BP-IVallosteric位点。通过KinomeEDGE筛选和SelectScreen等研究结果表明，BRAF构象的特异性结构变化以及PHI1与αCallosteric位点的相互作用导致PHI1对BRAF对其他激酶的特异性增加。

最后，评估PHI1对肺腺癌H2087和H1666细胞以及由RAS^MUT/BRAF^WT驱动的SKMEL-2和SKMEL-30黑素瘤细胞系的抑制作用。在非康奈非尼处理的细胞中，检测到PHI1的低p-ERK抑制(图5a，b)。相比之下，在康奈非尼预处理后，PHI1在H2087和H166肺癌细胞系中均表现出亚微摩尔p-ERK抑制，在H2087中具有更显著的作用(图4a，b)。综上所述，这些结果表明PHI1对BRAF二聚体的第二位点具有独特的特异性，并且在不同类型的BRAF抑制剂之间具有明显的正协同抑制机制。