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二次感染来势汹汹,看HiFi测序如何让Omicron无处遁形?!
【字体: 大 中 小 】 时间:2023年04月26日 来源:
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靶向捕获SMRT测序是一种有效的WGS、基因分型和检测SARS-CoV-2 Omicron变异株突变的方法。
★背景★
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS‐CoV‐2)大家都不陌生,它是由约29.9 kb的单链正义RNA组成的冠状病毒,可编码包括刺突(S)蛋白在内的几种蛋白质(S蛋白的作用是通过其受体结合结构域将病毒连接到宿主细胞受体上)。病毒基因组会积累与传播相关的突变来逃避中和抗体,因此在大流行期间SARS‐CoV‐2基因组分化产生了几种生物学和地理分布不同的变异毒株:Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(p.1)、Delta(B.1.617.2)以及全球传播的Omicron(B.1.1.529)。其中Omicron实现全球传播主要在于它比其他变异毒株的突变概率更高,传播性更强,更能逃逸免疫系统。所以不论基因组监测还是临床管理都需要快速识别有效传播或逃避宿主免疫反应的变异株。而人体内往往存在不同的变异株,怎么通过几个变异位点进行病毒准种的区分,这对测序方法的读长和准确度都有很高的要求。读长过短,不能区分距离较远的变异是否来自同一变异株,大大降低监测的精确性。
最近研究表明,PacBio SMRT测序可以提供更加准确的全基因组序列(WGS),可用于Alpha和Delta变异株的基因分型和检测突变。然而Omicron变异株的检测由于其高突变的特点会降低PCR的富集效率,还未有有效策略。基于此,题为“Whole-genome single molecule real-time sequencing of SARS-CoV-2 Omicron”的研究指出靶向捕获的单分子实时(SMRT)测序是一种有效的WGS、基因分型和检测SARS-CoV-2 Omicron变异株突变的方法。
该研究中,研究人员评估了靶向捕获SMRT测序方法在SARS‐CoV‐2 Omicron BA.2和BA.5变异株基因分型和检测突变方面的性能,并将其与针对Omicron变异株优化的基于扩增子的SMRT测序方法进行了比较。
★材料方法★
样本:
来自SARS‐CoV‐2 Omicron RNA阳性患者的172份鼻咽样本。
方法:
①基于靶向捕获的SMRT测序:使用了PacBio SARS‐CoV‐2富集试剂盒,基于1000个675 bp的分子探针对病毒全基因组进行22倍覆盖;
②基于1.2 kb扩增子的SMRT测序:基于SARS‐CoV‐2 Omicron基因组优化的29个1.2 kb扩增子进行全基因组扩增;
最后都在Sequel IIe平台上完成测序。
★结果★
1 基于靶向捕获的SMRT测序的Omicron全长基因组分析
基于靶向捕获对172个样本进行了测序,除去覆盖率过低的样本,共获得了146个(82%)样本的序列数据,每个样本的中位数为3828条reads,测序深度中位数为74×(图1A)。基因组覆盖率中位数为97.1%[IQR:60.9–99.2],80个样本(55%)的覆盖率>95%。大多数变异株属于Omicron分支21L(52;36%)和分支22B(59;40%)。
图1. 基于靶向捕获SMRT测序的SARS-CoV-2 Omicron全基因组分析。
2 基于扩增子的SMRT测序的Omicron全长基因组分析
使用扩增子方法对相同的172个样本进行测序(表1)。59个样本测序失败(34%)。11个样本在基因组中有10个以上的位置都出现10%-90%的核苷酸变异,这表明这11个样本中存在多个变异株。因此最后共获得了102个(59%)样本的序列数据,每个样本的中位数为24487条reads,测序深度中位值为93(图1B)。基因组覆盖率中位数为76%,19个样本(19%)的覆盖率>95%。变异株属于Omicron分支22B(52;51%)和分支21L(37;37%)。只有46个样本(45%)的分支未被确定,因为其余样本由于完整基因组的覆盖率太低,无法确定谱系。
图2. 基于扩增子SMRT测序的SARS-CoV-2 Omicron全基因组分析。
3 两种方法获得的全基因组序列的比较
研究人员对两种方法获得的148个样本的数据进行了比较。靶向捕获方法(9,6%)比扩增子方法(42,51.34%)产生的测序失败更少,靶向捕获方法更加有利于分支和谱系的确定。
靶向捕获方法提供的中位基因组覆盖率(98.6%)明显高于扩增子方法(76.6%)。靶向捕获方法分析的62个样本(64%)和扩增子方法分析的19个样本(19%)的基因组覆盖率>95%(p<0.05)。用两种方案测定的96个样本的分支一致性为93%,其中,59个样本的谱系是100%一致的。只有6个样本(#14、#30、#70、#84、#118和#131)的亚系不同,可能是因为1.2kb扩增子方法提供的基因组覆盖率低于靶向捕获方法。
分析造成差异的原因可能是:由于对于高变异的病毒而言,短扩增子方法比混合长扩增子方法更能从低病毒载量样本中生成完整的基因组。靶向捕获方法扩增SARS‐CoV‐2的675 bp短片段,而扩增子方法扩增1.2 kb的片段。这可能就是为什么特别在病毒载量较低的样本中靶向捕获方法表现更好的原因。
★讨论★
大规模、高通量的SARS-CoV-2全基因组测序对监测新变种的传播非常重要,特别是可能干扰疫苗接种或治疗的免疫逃逸变种。该研究检验了Pacbio SMRT测序对Omicron变异株的适用性,发现靶向捕获方法受BA.2或BA.5突变的影响较小。与扩增子方法相比,靶向捕获方法的测序失败率更低,并且给出了更多序列的>95%(ECDC推荐的最小值)的基因组覆盖率。因此,靶向捕获SMRT测序是一种有效的WGS、基因分型和检测SARS-CoV-2 Omicron变异株突变的方法。
综上,在三大测序技术中,不论是与读长≤1kb的一代测序还是200 bp短读长的二代测序相比,PacBio三代测序都可以凭借其既长(10-25 kb)且准(Q30)的特点,捕获变异株上的所有变异,更适于进行病毒准种和逃逸监测!
文献链接:
Whole‐genome single molecule real‐time sequencing of SARS‐CoV‐2 Omicron - Nicot - 2023 - Journal of Medical Virology - Wiley Online Library
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28564
基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。