中草药研究的现代化进程

近期发表在Horticulture Research上的一篇文章使用了HiFi测序技术，对桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）的基因组进行了完整的组装，并对其基因组进行了比较分析，以探究其进化历程和花青素积累机制。

云母屏开，珍珠帘闭，防风吹散沉香。离情抑郁，金缕织硫黄。柏影桂枝交映，从容起，弄水银堂。连翘首，惊过半夏，凉透薄荷裳。      

一钩藤上月，寻常山夜，梦宿沙场。早已轻粉黛，独活空房。欲续断弦未得，乌头白，最苦参商。当归也！茱萸熟，地老菊花黄。

中医文化源远流长，中药的名称婉转典雅，历朝历代的文人骚客，都喜欢拿这些药材的名字来作诗、填词。辛弃疾的这阙《满庭芳》就包含了25味中药材的名字。中药不仅在中国人精神文化生活中占有一席之地，其功效几千年来也在不断治愈着中国人。

2015年，中国科学家屠呦呦因在发现青蒿素方面的杰出贡献获得诺贝尔奖，刷新了全球对中医药的认知。毫无疑问，通过研究中医药，将会有更多促进健康的发现。近几十年来，许多植物化学和药理学研究了中草药的生物活性成分和潜在机制。然而，由于一代测序技术 Sanger 测序的成本高昂，长期以来中草药的可用遗传信息仍然缺乏。同时，二代测序NGS的缺点——尤其是读长短——成为阻碍草药基因组学发展的新瓶颈。由于读长只有150-200bp，使得原始片段很难组装成高质量的Contig或Scaffold，尤其是那些杂合度高或重复序列比例高的片段。然而，HiFi测序技术的发展为我们解决这些问题提供了一个很好的机会,帮助我们更好地理解草药基因组的组成和功能！

 HiFi助力中草药研究 

以HiFi测序为代表的三代测序技术，突破了二代测序GC偏好性及短读长对植物基因组组装的限制，HiFi reads（High Fidelity  reads）基于环形一致性测序（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式，产生出既有较长的读长（可达25kb的长度），又具有很高的序列精度（约99.9%准确率）的测序结果。这一技术对于基因组组装具有重要意义。不仅提高了组装效率、准确率，更重要的是能够实现gap-free组装，构建真正意义上的完整基因组图谱。

在中草药基因组研究中，HiFi测序可以被应用于多个方面：

01 基因组组装：HiFi测序可以提供较长的读长和高覆盖度，有助于更准确地组装基因组。

02 基因识别和注释：HiFi测序可以提供更准确的基因序列，有助于更准确地识别和注释基因。

03 基因家族分析：中药材基因组中存在很多基因家族，HiFi测序可以提供更准确的基因家族序列，有助于更准确地分析基因家族的进化和功能。

04 遗传多样性研究：HiFi测序可以检测到基因组中的低频变异和SNP等，有助于更准确地研究中药材的遗传多样性。

以栀子为例，建立在HiFi测序基础上的基因组数据，可应用如图1所示研究思路。

图1. 栀子基因组数据分析流程。栀子基因组数据分析主要包括基因组组装、注释，注释基因的比较分析和表达分析等

据《中国中草药图典》记载，桃金娘有养血止血，涩肠固经的功效，可用于治疗血虚体弱，吐血，鼻衄，劳伤咳血，便血，遗精，烫伤，外伤出血等症状。桃金娘所含色素对光和热稳定性很好，是很有前途的天然色素。近期发表在Horticulture Research上的一篇文章Gap-free genome assembly and comparative analysis reveal the evolution and anthocyanin accumulation mechanism of Rhodomyrtus tomentosa，使用了HiFi测序技术，对桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）的基因组进行了完整的组装，并对其基因组进行了比较分析，以探究其进化历程和花青素积累机制。

首先，研究人员使用PacBio的HiFi测序技术辅之以Hi-C技术对桃金娘的基因组进行测序和gap-free组装。在桃金娘的基因组组装中，HiFi测序技术产生的Contig N50至少有16kb，比之前采用的二代测序技术要长得多, 大大减少了基因组的碎片化和重复序列的拼接难度。该基因组的大小约为470.35Mb，共注释了33382个基因和239.31 Mb（50.92%）的重复序列，其中 190.23 Mb（79.42%）的序列属于长末端重复逆转录转座子，如图2所示。

图2. 桃金娘基因组信息。A.桃金娘图片 B.Hi-C结果图 C.桃金娘基因组中基因密度和端粒和着丝粒的分布 D.桃金娘的基因组特征，从圈内到圈外依次为基因组共线性位点分布、GC含量、长末端重复序列 (LTR) 密度、LTR 密度、总LTR密度，总TE密度

随后，研究人员使用了多个物种的基因组序列作为比较对象，包括一些已经被广泛研究的植物基因组，通过进化基因组学分析揭示了桃金娘的进化历程，如图3所示。研究表明，桃金娘在66.58–95.50 MYA时期发生了全基因组复制。基因共线性分析表明石榴染色体的重组在桃金娘科植物的物种形成中起着重要作用。同时，巨桉相对于桃金娘的染色体倒位要比番石榴相对于桃金娘发生的染色体倒位更多，这些倒位可能推动了桃金娘的分化，如图4所示。

图3. 桃金娘和其他物种之间的系统发育和共线性分析。节点上的值代表从现在开始的分歧时间（单位：百万年前，MYA）；红色三角形显示桃金娘科中的 WGD 事件

图4. 基因共线性分析

为了探索桃金娘器官中的基因表达模式，将来自不同器官和发育阶段的十种样本中的在基因组复制后出现的25038个表达基因分成26个表达模块，并进行加权基因相关网络分析（WGCNA），如图5所示。相关性分析检测到器官和样品发育阶段高度密切相关的共表达模块。其中，module24中的基因在与类黄酮合成和代谢相关的途径，特别是花青素合成和代谢途径中高度富集。研究人员在桃金娘中鉴定了四种主要的花青素化合物及其合成途径。比较基因组和基因表达分析表明，桃金娘的着色和高花青素积累往往是由花青素合成途径的激活决定的。MYB转录因子的正向选择和上调是这一过程的隐性因素。

图5. 桃金娘不同组织中的基因表达模式。桃金娘不同组织、发育阶段与基因表达模块之间相关性的热图。不同模块和样本之间的相关系数由单元格的颜色和单元格内的文本表示（上面的数字是 Pearson 相关系数，下面的数字是 P 值）。红色和蓝色分别表示正相关和负相关

本文借助HiFi测序技术实现了桃金娘的Gap-free基因组组装、通过比较基因组学分析、RNA-Seq和代谢组学分析等方法，揭示了桃金娘的基因组演化历程以及花青素积累的机制。这些结果对桃金娘的进化及遗传改良等具有重要意义，对植物基因组学、代谢组学等相关领域的研究也具有推动作用。

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