Nat.Commun.丨LI-COR Odyssey联合Covaris AFA技术助力解析高血糖诱导乳腺癌疾病表观遗传调控机制

LI-COR Odyssey双色近红外荧光成像技术是定量Western Blot数据获取的重要工具，Covaris 非接触式聚焦超声技术（AFA）可提供标准化的染色质制备和剪切的方案以获得ChIP-qPCR、ChIP-Seq完整数据。

　　

LI-COR Odyssey双色近红外荧光成像技术是定量Western Blot数据获取的重要工具，Covaris 非接触式聚焦超声技术（Adaptive Focused Acoustics，AFA）可提供标准化的染色质制备和剪切的方案以获得ChIP-qPCR、ChIP-Seq完整数据。近期一篇关于在高血糖诱导的乳腺癌疾病中神经调节蛋白-1（Neuregulin 1，Nrg1）表观遗传调控机制的文章联合使用上述两种技术在主流期刊Nature Communications上发表，解析了高血糖诱导Nrg1表观遗传调控分子机制。

文中指出高血糖会引起Nrg1增强子区域活跃组蛋白修饰，通过募集免疫球蛋白kappa J区重组信号结合蛋白（RBPJ）、E1A 结合蛋白 p300和含SET结构域蛋白1A（SETD1A）形成增强体复合体上调 Nrg1表达水平。最终发现与高血糖相关的Nrg1表观遗传调控机制可作为治疗乳腺癌-糖尿病患者的潜在治疗策略。

高血糖上调Nrg1表达，促进癌细胞增殖

作者通过定量PCR和定量Western Blot实验获得低浓度葡萄糖（LG）和高浓度葡萄糖（HG）处理乳腺癌细胞系Met1、4T1和Eo771后Nrg1基因mRNA和蛋白质表达水平的数据。证实了HG上调癌细胞中Nrg1基因mRNA和蛋白质的表达以及细胞的增殖。

图1. 高血糖上调Nrg1表达，促进癌细胞增殖。a：低浓度葡萄糖（LG）和高浓度葡萄糖（HG）条件下乳腺癌细胞Met1、4T1和Eo771中Nrg1基因相对mRNA表达水平分析。b：Western Blot分析使用HG以梯度时间处理Met1、4T1和Eo771细胞系后NRG1和β actin 蛋白表达水平。c-e：LG和HG处理乳腺癌细胞系后的细胞增殖分析。f,h：Western Blot验证shScrb（阴性对照）和shNrg1表达的癌细胞Met1和4T1中Nrg1基因沉默，以及g,i为HG处理后实验组与对照组的细胞增殖分析和曲线下方面积的定量分析（AUC）。

高血糖提高Nrg1增强子区域活跃组蛋白信号

文中通过大量的ChIP-qPCR实验分析了高血糖对Nrg1增强子区域活跃组蛋白的影响和高血糖条件下参与Nrg1过表达过程的染色质重塑因子P300/CBP和SETD1A。HG会提高活性增强子信号H3K27ac（组蛋白H3上第27位赖氨酸残基发生乙酰化修饰） 和 H3K4me1（组蛋白H3上第4号赖氨酸残基发生1个甲基化修饰）在增强子区域的富集程度和染色质的开放性（Nrg1 增强子区域+200 bp）。作者又使用曲古菌素A (TSA)抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性，qPCR和Western Blot结果显示HG显著增加了Met1和4T1细胞中Nrg1基因mRNA和蛋白表达水平，证明了H3K27组蛋白乙酰化会上调Nrg1的表达。同时使用western blot实验进行验证，通过将P300、CBP和SETD1A基因沉默实验组与未沉默处理的对照组细胞中Nrg1表达水平进行对比，确认了P300、CBP和SETD1A与Nrg1增强子复合体的组装相关。

图2. 高血糖提高Nrg1增强子区域活跃组蛋白修饰。a：Nrg1基因与其增强子区域。Nrg1增强子序列长度为0.6kb，位于小鼠第8号染色体：32,200,290–32,199,690。增强子中心区域标记为‘0’，引物对用相同颜色的箭头表示。b,c：ChIP-qPCR分析LG和HG处理Met1细胞后Nrg1增强子区域H3K27ac和H3K4me1富集。d：qPCR分析Met1、4T1和Eo771癌细胞中Nrg1增强子区域(+200 bp)染色质开放性。e,f：LG条件下曲古菌素A处理后Met1细胞中Nrg1基因mRNA和蛋白质表达水平。g–j：ChIP-qPCR分析HG处理Met1细胞0h、3h、6h后Nrg1增强子区域P300、CBP、SETD1A和HDAC1四种蛋白结合情况。k：Western Blot分析LG和HG处理Met1细胞后SETD1A 和HDAC1蛋白胞内定位。l：Western Blot分析HG处理通过shScrb, shP300, shCbp和shSetd1A进行基因沉默的Met1细胞以及阴性对照组细胞72小时后NRG1蛋白表达水平。m：对HG处理的过表达scrambled（阴性对照）和Setd1A shRNA的met1癌细胞进行细胞增殖分析。

高血糖通过募集RBPJ到活跃增强子区域调节Notch信号通路上调Nrg1表达

作者通过Western Blot、ChIP-qPCR等实验探究Notch信号通路是否参与到HG-乳腺癌细胞中Nrg1过表达过程。答案是肯定的，HG会激活Notch信号通路，并促进NICD和RBPJ被募集到Nrg1增强子区域。

图3. 高血糖促进Notch信号通路激活和RBPJ结合到Nrg1增强子区域。a：Western Blot分析HG处理Met1细胞0h、24h、48h、72h后NICD(NOTCH 胞内结构域)蛋白水平。b：HG条件下Notch信号通路靶基因的mRNA水平。c：ChIP-qPCR分析Met1细胞中Nrg1增强子区域NICD结合情况。d：图示代表Nrg1增强子区域(+108/114 bp)中RBPJ的结合位点。e：ChIP-qPCR 分析LG和HG处理Met1细胞后Nrg1增强子区域RBPJ结合情况。f：在转染RBPJ的Met1细胞中含有对照或Nrg1增强子序列的pGL4.23载体的荧光素酶报告活性分析。g：LG和HG处理Met1细胞后含有阴性对照、增强子、1kb启动子和带有1kb启动子的增强子的四种pGL4.23载体的荧光素酶报告活性分析。h：LG和HG处理Met1细胞后Nrg1启动子(−1316, −116 bp from TSS) 和增强子区域(+100, +200 bp from center of theenhancer)染色质可及性分析。i：Rbpj基因和 Notch靶基因mRNA水平分析。j：LG和HG处理转染阴性对照scramble和siRbpj的Met1细胞后NRG1 和RBPJ蛋白水平分析。k：与阴性对照组相比，使用DAPT处理LG和HG处理条件下Met1细胞后NRG1和NICD蛋白表达水平分析；Notch靶基因的mRNA水平分析（l）；细胞增殖分析（m）。

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文中所有的定量Western Blot实验数据均由LI-COR Odyssey近红外荧光成像系统扫描获取；ChIP-qPCR实验中样本制备到染色质剪切步骤均由基于AFA技术原理的Covaris S220系统搭配truChIP® Chromatin Shearing Kit试剂盒实现，纯化DNA后成功获得片段集中在200–500 bp的DNA片段用于qPCR分析。

图4. LI-COR Odyssey近红外荧光成像扫描仪新型号DLX图片（左），文中仪器信息（右）。

图5. 基于AFA技术的Covaris S220与试剂盒（左），文中仪器信息（右）。

LI-COR Odyssey 双色红外激光成像系统

LI-COR Biosciences公司作为近红外荧光成像的创始者，在近红外荧光成像领域已有25年的积淀。

25年来，LI-COR Odyssey双色近红外荧光成像系统由于可实现Western Blot精确定量，多重Western Blot检测，且重复性更高，通量更高，拥有丰富的应用范围，因而得到了全球生物医学研究人员的信赖。

可实现丰富的应用

Covaris AFA高性能样本处理系统

Covaris公司一直致力于研发基于声学、机械及分子生物学的高性能组织样本处理系统，旨在帮助研究者实现快速、稳定、高效样品的预处理，其相关产品线从低通量到高通量、从低功率到高功率，满足您的不同实验需求。

Covaris自动声波聚焦技术（Adaptive Focused Acoustics,AFA)，是在传统超声波处理基础上的技术革新，通过球面固态超声换能器将声波聚集到样本区域，对样本进行处理。聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩引起的样本处理过度及热损伤。Covaris AFA通过精确的计算机控制系统和自动化的仪器操作，为样本处理提供高效可控、重复性优良、温度恒定及无污染的处理环境。

AFA技术在ChIP-Seq应用的优势：

1. 随机剪切保证了无偏好性的染色质片段化。

2. 紧密的片段大小分布确保构建的测序文库具有综合的代表性。

3. 可重复性剪切允许比较不同来源的样本，如癌症亚型或进展性疾病的不同阶段的样本。

4. 恒定低温保护了蛋白质抗原表位，有利于下游IP实验中抗体的结合以及完整数据的获取和分析。

除ChIP实验外，AFA还可助力NGS文库构建、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案......

参考文献：Lee, C., et al. (2023). "Epigenetic regulation of Neuregulin 1 promotes breast cancer progression associated to hyperglycemia." Nat Commun 14(1): 439.

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36179-8

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基因有限公司作为Covaris和LI-COR Biosciences公司在中国的合作伙伴和全国代理商，为您提供定量Western Blot、DNA片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案等。基因有限公司的宗旨是“专才为专家服务”，有专业团队为各大科研机构提供安装培训，技术支持，应用培训与售后维护一条龙服务，赢得客户的一致好评与信任。想要了解更多，请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司员工。