李毓龙实验室：开发新型GRAB荧光探针，解析睡眠觉醒过程中组胺动态变化

　　

组胺（histamine，HA）是一种重要的单胺类信号分子，广泛分布于中枢神经系统和外周组织，参与免疫、消化和神经信号调控。抗组胺药物常被用来治疗过敏和胃酸分泌过多，而抗组胺药物的一大副作用是嗜睡，引起科学家对中枢组胺系统的关注。在中枢神经系统，组胺神经元胞体位于下丘脑结节乳头体核（tuberomammillary nucleus, TMN），其神经纤维向全脑广泛投射。组胺在中枢系统参与睡眠觉醒、学习记忆和摄食等行为。迄今，与组胺信号传递相关的生理功能及作用机制仍有很多未解之谜，其中一个主要的原因是缺乏灵敏、特异、高时空分辨率监测组胺动态变化的工具。

2023年3月16日，北京大学李毓龙实验室在Neuron杂志在线发表了题为Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo的研究论文，报道了新型基因编码的组胺探针GRABHA的开发以及在体外和活体动物的应用；应用新型高时空分辨率和灵敏度的组胺探针，深入探究了组胺在睡眠觉醒过程中的动态变化。李毓龙实验室一直致力于系统性地发展神经化学分子检测技术，先后开发了针对乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、嘌呤类、脂类和多肽类神经递质/调质的荧光探针，此次发表的GRABHA是其又一力作，进一步拓展了GRAB系列荧光探针家族。这些探针的开发和应用有力地推动了神经科学、生理学和药理学等研究进展。

在这一工作中，李毓龙实验室首先灵活运用GRAB策略（GPCR-Activation Based Sensor）将循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP嫁接到人源组胺受体H1R、H2R、H3R或H4R的第三个胞内环，发现基于H4R的探针表现出优于其他受体的细胞膜定位特性，后续通过一系列优化，获得了基于H4R的组胺荧光探针GRABHA1h （简称HA1h）。在HEK293T细胞表达的HA1h探针对外源加入的组胺有~370%的荧光信号响应（ΔF/F0）和~17 nM的亲和力（EC50）（图1）。基于组胺受体结构，还开发了对组胺不敏感的对照探针GRABHA1mut （简称HA1mut）。为了进一步拓展探针对组胺浓度的检测范围，，筛选了不同物种的组胺受体，开发了基于水熊虫（water bear，tardigrade）H1R的组胺荧光探针GRABHA1m （简称HA1m）。在HEK293T细胞表达的HA1m探针对外源加入的组胺有~590%的荧光信号响应（ΔF/F0）和~380 nM的亲和力（EC50）。此外，HA1h和HA1m探针能在亚秒级（~0.3-0.6 s）时间尺度上响应胞外组胺浓度变化，且几乎不激活GPCR下游信号通路。进一步研究发现这两个探针具有很好的分子特异性，对组胺的前体和代谢产物以及其它测试的神经递质均不响应，且保留了相应受体的药理学特性。

图1：新型组胺探针的刻画。A, 组胺探针工作原理。B, 组胺探针HA1h、HA1m和HA1mut在HEK293T细胞上的表达及对组胺的反应。C, 组胺探针对饱和浓度组胺的响应曲线。D, 组胺探针HA1h和HA1m对不同浓度组胺的信号响应。

组胺探针是否有潜力检测内源组胺的释放呢？作者借助AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC），成功记录到小鼠急性脑切片电刺激引起的组胺释放，信号上升的时间常数（τon）在~1.4-5.2 s，且能看到探针信号从刺激开始会从刺激位置向外传播。因此，HA1m组胺探针可以实现高时空分辨率地检测内源组胺的释放。

组胺是调控睡眠觉醒的重要分子。视前区（preoptic area, POA）是参与睡眠觉醒调控重要的脑区，且接收组胺能神经元密集的投射。作者利用AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的视前区，通过光纤光密度法检测探针信号，同时记录小鼠脑电和肌电来判断睡眠状态。结果发现在小鼠REM睡眠向觉醒转换和NREM睡眠向觉醒转换过程中组胺信号升高，在觉醒向NREM睡眠转换和NREM睡眠向REM睡眠转换过程中组胺信号下降。作者进一步通过在组胺合成酶敲除（HDC KO）的小鼠中发现，没有观察到HA1m探针信号明显变化。综上所述，HA1m探针可以可靠地在体检测组胺的动态变化。

图2：不同核团组胺动态变化动力学在睡眠时相转换过程中存在差异。A, 探针表达和记录示意图。B, HA1h探针在PFC和POA的动态变化曲线。

组胺神经元胞体位于下丘脑结节乳头体核，并向全脑发出广泛投射。那么，组胺在不同脑区的动态变化的模式是一致，还是不同呢？作者将HA1h探针表达在小鼠的视前区和前额叶皮层，记录了这两个脑区的组胺在睡眠觉醒中的动态变化（图2）。结果发现，两个脑区组胺探针信号大小在相同睡眠时相时是一致的。有趣的是，在REM睡眠向觉醒转换、NREM睡眠向觉醒转换和觉醒向NREM睡眠转换过程中，视前区的组胺变化动力学比前额叶皮层更快。利用新开发的组胺探针，作者发现不同脑区的组胺动力学存在差异，为研究组胺的功能提供了重要的启示。

除了睡眠觉醒调控，组胺还参与多种生理和病理过程，包括摄食、运动、认知、癫痫和偏头痛等。乃至，在外周系统组胺还参与过敏、瘙痒和胃酸分泌等过程。另外，组胺是果蝇的视觉系统中的重要的神经递质。相信新的组胺荧光探针GRABHA将会成为研究组胺在生理和病理条件下的功能和机制的强有力工具。

图形摘要：组胺荧光探针GRABHA的工作原理及离体和在体应用。

北京大学生命科学学院博士后董辉和博士生李梦尧（已毕业）为本文共同第一作者，李毓龙教授为通讯作者，实验室成员鄢羽岐、钱统瑞、林云致、刘灿、李国川和王欢对文章做出了重要贡献。该工作得到了阿姆斯特丹自由大学（Vrije Universiteit Amsterdam） Rob Leurs教授及其团队Xiaoyuan Ma和Henry F. Vischer的通力合作。

更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/。此外，李毓龙实验室诚聘不同学科背景的副研究员、博士后及技术员，待遇从优。欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入！

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.02.024

参考文献：Dong et al., Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo, Neuron (2023)

作者简介：

李毓龙

荧光探针、神经成像、突触传递、信号转导、神经疾病

研究兴趣：

人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知觉、决策和运动等高级神经功能。

研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。

具体而言，对于工具开发，我们集中于：

1、结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。

2、开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。

        利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：

1、结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。

2、寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。

3、结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。