基于Iso-seq揭秘胚胎形成中的poly(A)调控

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所陆发隆团队与多个团队合作，通过基于PacBio的PAIso-seq和PAIso-seq2技术发现在人类OET过程中mRNA poly(A)尾的全局性重塑。

　　

Background

卵母细胞到胚胎的转变(oocyte-to-embryo transition，OET)是卵母细胞经历成熟和受精，最终形成一个可以支持新生物体的完全发育的全能胚胎的过程。OET的特征是在合子基因组激活之前没有转录，在此期间，各种事件由母源mRNA的转录后调控来控制。Poly(A)尾介导的母源mRNA转录后调控在OET中有重要作用，然而关于哺乳动物和人类OET过程的研究很少，即使是单个基因也完全未知。

Poly(A)尾以非模板的方式添加到大多数mRNA的3'端，并在转录后调控中发挥增加mRNA稳定性，提高翻译效率等重要作用。检测poly(A)尾对于理解其在生物中的调控作用至关重要。然而，由于二代测序技术读长较短，需要将完整的cDNA打成小片段进行测序，很容易导致部分片段或者某一端的缺失，很难得到完整的全长转录本，也无法全面表征所有异构体。除此之外，Illumina平台上的测序质量在均聚物上会迅速退化，这使其无法对长度超过约30 nt的均聚物序列进行测序。纳米孔测序可以量化poly(A)尾长度，但无法测量poly(A)尾中的非A碱基。PacBio平台的全长poly(A)mRNA测序（FLAM-seq）可以准确量化poly(A)尾长并测量其中的非A碱基。但是上述所有方法都需要微克水平的起始RNA量，因此限制了其在哺乳动物和人类中的研究。

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所陆发隆团队与东北林业大学刘玉胜团队、山东大学生殖医学研究中心陈子江/赵涵/吴克良团队、中国科学院动物研究所周兵团队以及东北农业大学王加强团队合作在Nature Structural & Molecular Biology发表了一篇题为Remodeling of maternal mRNA through poly(A) tail orchestrates human oocyte-to-embryo transition的研究论文，通过基于PacBio的PAIso-seq和PAIso-seq2技术发现在人类OET过程中mRNA poly(A)尾的全局性重塑。

研究方法：

研究团队此前开发了一种基于PacBio HiFi测序的包含poly(A)尾全长RNA异构体测序方法(poly(A)inclusive RNA isoform-sequencing，PAIso-seq)， 该方法能以单卵母细胞水平灵敏度(单个哺乳动物卵母细胞含有约0.5 ng的总RNA)精确测量poly(A)尾长和poly(A)尾中的非A碱基以及全长cDNA，为研究珍贵的体内样本提供了机会。

但是由于PAIso-seq从原理上需要RNA的3′端有十几个A碱基才能将其有效捕获，所以不能检测poly(A)尾很短的mRNA，或在3 '端有非A碱基的mRNA。因此，研究人员开发了PAIso-seq2(详见参考文献2)，该方法可以检测到极短或无poly(A)尾的转录本，以及在其3'端有非A碱基的转录本，尽管敏感性较低。

图1. PAIso-seq和PAIso-seq2捕获不同类型转录本的原理和能力

研究结果：

研究人员将PAIso-seq应用于生发囊泡、中期I和中期II阶段捐赠的人类卵母细胞，以及1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚阶段的着床前胚胎，共计分析了24个卵母细胞、31个着床前胚胎以及18个短干扰RNA(siRNA)介导不同基因敲除的人类1-细胞胚胎(图2)。

图2. PAIso-seq检测人类卵母细胞和早期胚胎的数量

从73个卵母细胞和胚胎中获得了总共1600万个包含poly(A)尾的全长cDNA。经过分析发现，人类OET过程中转录组的poly(A)尾长度发生了剧烈的变化(图3左)。在卵母细胞成熟阶段，poly(A)尾 25-60 nt的转录本的相对丰度在中期I阶段下降，在中期II阶段进一步下降，这表明母源mRNA发生了整体脱腺苷酸化。受精后，在1-细胞、2-细胞和4-细胞胚胎中，具有 12- 60 nt poly(A)尾的转录本的相对丰度增加，这表明了全局聚腺苷酸化。

图3. 转录本的poly(A)尾长分布

左：PAIso-seq；右：PAIso-seq2

接着，他们使用PAIso-seq2来测量PAIso-seq不能有效捕获的转录本，并分析生发囊泡和中期II阶段的卵母细胞以及1-细胞、2-细胞和4-细胞阶段的胚胎，共计获得了332万个包含poly(A)尾的全长cDNA。在PAIso-seq2数据集补充了poly(A)尾长度在20 nt以下的转录本（图3右）以及末端有非A碱基转录本。PAIso-seq和PAIso-seq2数据相互支持，交叉验证了在人类OET期间，母源mRNA重塑发生在全局脱腺苷酸化之后再聚腺苷酸化的发现。

研究人员对比了不同阶段母源mRNA的poly(A)尾，在1-细胞、2-细胞和4-细胞胚胎中发现了两个非常有趣的特征：(1)出现了许多具有缩短的3'-未翻译区域(3'- UTR)的聚腺苷酸化转录本的出现(图4中紫色点矩形)。(2)出现了许多非A碱基(图4 poly(A)尾中除了青色以外的颜色)。

图4. 两个代表性基因的PAIso-seq读取对齐视图

结合siRNA对poly(A)尾的候选调控因子进行敲除，研究团队揭示了人类OET期间母源mRNA poly(A)尾介导的全局性重塑机制(图5)：在卵母细胞成熟过程中先经历BTG4依赖的全局脱腺苷酸化，之后母源mRNA可被外切酶(包括XRN1和外泌体)降解形成降解中间体或在TUT4/7的作用下发生尿苷化(I)。同时3 ' -UTR部分降解的母源mRNA也可发生尿苷化(II)。此外，poly(A)尾很短的脱腺苷酸化母源mRNA(①)、尿苷化母源mRNA(②)、3 ' -UTR部分降解母源mRNA(③)和II的尿苷化母源mRNA(④)均可发生再聚腺苷酸化。这些再聚腺苷酸化事件伴随着TENT4A/B依赖的G碱基的掺入，从而稳定新生成的poly(A)尾巴。值得注意的是，抑制多聚腺苷酸(黑色虚线)会导致受精卵第一次卵裂失败，母源mRNA重塑是第一次卵裂所必需的。

图5. 人类OET过程中多(A)尾动力学过程

参考文献：

1.https://doi.org/10.1038/s41596-022-00704-8

2.https://doi.org/10.1007/s11427-022-2186-8

3.https://doi.org/10.1038/s41594-022-00908-2

Summary

上述研究揭示了广泛的poly(A)尾动态变化，并为人类OET过程中潜在的调节机制提供了证据。基于Iso-seq而开发的poly(A)尾全长转录组测序能准确测出poly(A)尾长以及非A碱基，以极低的起始量获得完整的包含poly(A)尾的全长转录本，在该研究中起到了重要作用。

除了研究多聚腺苷酸化，Iso-seq还能用来揭示复杂可变剪接，检测融合基因，鉴定等位基因特异性异构体等，帮助老师们在转录组层面进行更深层次的机理性研究！

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