PNAS｜孙宇辉组发表链霉菌三维基因组解析及高产天然产物应用成果

　　

染色质作为生命遗传信息的载体，它在细胞中的三维空间结构精密而复杂，并与各种生命活动及基因表达调控相密切相关。微生物天然产物是人类药物来源的丰富宝库，研究表明许多负责天然产物生物合成的基因簇在实验室培养条件下都处于沉默或者低表达的状态，为尚待开发的“暗物质”。为了充分发掘和利用自然界这一宝贵资源，目前主流的方法包括外在培养条件的优化和一维水平下内在代谢工程改造等。该研究以饱含天然产物生物合成基因资源的链霉菌为研究材料，通过揭示和利用染色质高级结构与天然产物生物合成基因簇表达的规律，为高产天然产物提供了一个新的维度和视角（图1）。

图1. 链霉菌三维基因组空间结构与天然产物生物合成基因簇表达的相关性示意图

（黄色、橙色、红色染色质分别表示互作频率为低、中、高的局部染色质区域；蓝色区域表示天然产物生物合成基因簇）

链霉菌生物合成基因簇的表达往往具有严谨的周期特征，即在指数生长中期（M期）之前保持沉默，在指数生长后期（L期）开始表达。因此，该研究首先利用高通量染色质构象捕获技术（High-throughput chromosome conformation capture, Hi-C）对处于这两个生长时期的模式链霉菌——天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）进行全基因组互作信息捕获，并获得高分辨率的染色质互作热图（图2A，B），还考察了多类型的染色质三维结构特征，包括伴随生长周期变化的全局染色质结构适应性调整（图2C）、拟核互作结构域（Chromatin interaction domain, CID）的鉴定和动态变化分析（图2D）、CID边界基因特征分析和功能鉴定、基因水平转移区的显著互作变化、遗传分区与结构分区之间的不对应现象等。

图 2. 天蓝色链霉菌指数生长中期和后期染色质互作及特征染色质区域

其次，该研究还着重比较了天蓝色链霉菌中所有28个生物合成基因簇随着生长时期转变，转录水平与局部染色质结构变化的关联性，发现负责十一烷基灵菌红素（Undecylprodigiosin）生物合成的基因簇（red）在M到L期的转变中转录表达量提高了143倍，并重新定位于新产生的染色质嵌合结构域边界区（图3A，黑线折线顶点）。而另一天蓝霉素（Coelimycin P1）生物合成基因簇（cpk）在M到L期的转变中转录表达量有了极大的提高，高达541倍。同时，让人惊奇的是，伴随这一高表达现象，在L期整个基因簇形成了独立的染色质局部结构（图3B，黑色三角区域），将其与周围染色质区分隔开，而且这个结构的边界区与整个染色质都存在明显互作（图2B和图3B，橙色箭头），这从一个更高的维度揭示出了一种全新的次生代谢调控机制，它表明链霉菌中天然产物的生物合成与染色质高级结构存在紧密联系，为其潜在的应用提供重要的理论基础。

图3.生物合成基因簇red 和cpk的高表达伴随着局部染色质结构的重排

为了进一步考察染色质三维结构特征对于生物合成基因簇表达调控的影响，该研究采用优化后的特征参数（Frequently interacting region value, FIRE值）对染色质区域互作频率进行表征，并在全基因组水平上考察它和相应内在基因转录水平的关系。结果发现在M和L两个生长时期，FIRE值与基因转录之间存在明显的相关性（图4A）。为了探究染色质局部互作频率是否能直接影响该区域基因的表达，该研究将FIRE值与内在基因转录水平相关性大于0.8的染色质区定义为高相关性区域（High correlative region, HCR），然后按等分原则分别选定了FIRE值梯度变化的10个HCR区域（M期， HCR-M1~10；L期，HCR-L1~10）。随后将β-葡萄糖苷酶编码基因gus(a)作为报告基因分别插入这20个HCR区域，并分别测试报告基因在这些区域的表达强度。结果显示，在M和L两个时期，报告基因表达强度与FIRE值都高度相关（图4B），并且表达量差异最高可达22倍。以通用的异源表达整合位点attB为对照，整合到高FIRE值HCR区域的报告基因表达量提升最高可达约2倍（图4B，红线为对照），这表明该方法用于激活或高产天然产物的潜在应用价值。为了进一步验证所揭示出来的这一规律的实用性，将来自链霉菌Streptomyces sp. 88-682中负责天然产物RK-682生物合成的一个11.8 kb基因簇分别插入这20个HCR区域，并进行产量检测。结果显示，在M和L两个生长时期，RK-682产量与FIRE值同样高度相关（图4C），并且表达量差异最高可达30倍之多。与作为对照的attB整合位点的产量相比，在高FIRE值HCR区域上的产量提升最高可达到4.3倍（图4C，红线为对照）。这些结果不仅证明了染色质局部互作频率可以显著影响置入其中的内源或外源基因或基因簇的表达，并且实现了天然产物的高产。

图4. 天蓝色链霉菌指数生长中期和后期染色质互作频率与基因表达的相关性

（ B 和 C 中红色横线分别表示报告基因 gus(a) 和 RK-682生物合成基因簇 插入作为对照位点 attB 的β - 葡萄糖苷酶和 RK-682 的产量。图中各点的数值表示插入在不同互作强度染色质区域的报告基因和基因簇与插入对照位点 attB 的报告基因和基因簇表达产物的比值）

武汉大学药学院孙宇辉教授为该论文通讯作者，博士生邓梁和北京生物技术研究所赵志虎研究员为该论文共同第一作者，武汉大学为该论文第一署名单位。该研究得到了国家重点研发计划项目的支持。