川大华西医院苏昭铭研究员团队在Nature Catalysis发文：揭示四膜虫核酶内含子剪接过程构象

　　

2023年3月16日，我院生物治疗国家重点实验室苏昭铭研究员团队在Nature Catalysis（IF：40.706）在线发表文章：Cryo-EM reveals dynamics of Tetrahymena group I intron self-splicing。研究通过体外转录共折叠后获得正在进行剪接反应的四膜虫I类内含子，并直接运用冷冻电镜在两个样品中捕获了剪接过程中第一步、第二步以及环化反应共六种不同构象（分辨率在2.84 — 3.73 ?），极大完善了人们对该内含子完整剪接过程的理解(图1)。

图 1 四膜虫I类内含子自剪接过程

RNA作为生命科学“中心法则”中极其重要的生物大分子，通过形成三维结构参与诸多重要的生命过程。核酶（ribozyme）是一类在没有蛋白参与情况下能催化化学反应的RNA，最早由Thomas Cech发现并命名。1982年，Thomas Cech等在嗜热四膜虫中发现了I类内含子可以通过两步化学反应完成自我剪接过程，并获得了1989年诺贝尔化学奖。随后四十年来，四膜虫核酶成为了研究RNA三维结构与催化功能关系的范式，包括Thomas Cech、Thomas Steitz、Jennifer Doudna在内的科学家都对其部分结构进行过解析。2021年，苏昭铭课题组联合斯坦福大学Rhiju Das和Wah Chiu团队首次解析了全长四膜虫核酶的3.1?冷冻电镜结构(Nature, 2021)，并揭示了结合底物前后的构象变化。然而，人们对该内含子通过两步化学反应完成自我剪接这一完整动态过程以及过程中发生的构象变化仍然知之甚少。

在以往的研究中，RNA样品通常通过体外转录、切胶纯化、变性复性的方法来制备。本研究中内含子RNA在体外转录过程中直接折叠并开始剪接反应，减少了人为干预，使得观察到的结构更接近天然构象。在第一步反应过程中，5'端外显子和内含子会形成P1双螺旋，从起始位置经过中间位置到达剪接位点；活性中心附近的三个单链片段（J8/7、J4/5、J5/4）与P1形成长程相互作用来介导正确剪接位点；完成第一步反应后，3'外显子通过构象变化形成新的P10双螺旋，并进行第二步反应；随后连接好的成熟外显子被释放，内含子5'端重新折叠成新的P1'并回到起始位置，准备进行下一步环化反应。

本研究中，团队还首次发现在第二步反应过程中，相隔400多个碱基的两段外显子还可以和内含子形成一个始料未及的假节结构：5'外显子和5'内含子形成P0，5'和3'外显子形成P0'。通过生化方法对这两部分结构进行突变发现，P0对第二步剪接反应速率起到抑制作用，很可能是由于新形成的复杂三维结构阻碍了连接的成熟外显子释放，从而促进了逆反应的发生，降低了正向反应的速率（图2）。研究人员在更接近天然状态的结构中进一步鉴定出33个金属离子，包括一个之前从未在结构中观察到的金属离子，并验证了第二步反应是通过经典的两金属离子反应机制。

图 2 四膜虫I类内含子和两端外显子形成新的三维结构来调控第二步剪接反应

本研究在原子水平上揭示了较为完整的四膜虫I类内含子自剪接过程，验证了冷冻电镜捕获动态RNA结构改变的能力，这也将成为越来越多生命科学动态过程结构研究的重要方法。

我院科研助理罗炳男、博士生张冲为本文共同第一作者；我院苏昭铭研究员为通讯作者。生物治疗国重实验室冷冻电镜平台及杜宇高性能计算中心完成了本项目的数据收集和处理工作。该研究工作得到国家科技部重点研发计划、国家自然科学基金项目、四川大学华西医院1·3·5计划项目等经费支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41929-023-00934-3