如何快速确认基因编辑实验结果？

由于基因编辑是在微观的分子结构上对基因组进行定点改变，那么在完成基因编辑实验后怎样才可以快速 “见著知微” 地确认基因编辑实验结果呢？

Takara以下5款“黑科技”产品，我不希望还有人不知道！

1、基因编辑后突变检测

用途：确认CRISPR/Cas9等多种基因编辑方式所产生的基因突变。

产品特点：

√ 直接以细胞为起始进行PCR扩增，可简便快速地检测出基因突变

√ 可用于检测多种基因编辑方式所产生的基因突变

√ ALL-IN-ONE型试剂盒，包含Guide-it Resolvase、Terra PCR Direct Polymerase和所有缓冲液

实验案例：Guide-it Mutation Detection Kit 与其他公司同类产品的比较

转染表达Cas9核酸酶的质粒和特异作用于AAVS1位点的sgRNA至293T细胞，转染48 hr后收集细胞，将其与未经转染的细胞按照不同比例进行混合，分别进行突变导入检测。采用Terra PCR Direct Polymerase Mix扩增含有AAVS1位点的目的片段并纯化其产物，之后分别采用Guide-it解离酶和Cel1酶（Surveyor assay）进行剪切。采用Guide-it解离酶剪切后条带清新易于识别，而Surveyor assay剪切后则显示明显的弥散，这样使得不容易测定突变效率并且低水平突变导入很难检测得到。

* 数据来源于Takara Bio USA, Inc.

2、基因编辑后基因敲入检测

用途：检测由同源重组所产生的基因组编辑、单核苷酸替换、鉴定识别含不同等位基因的杂合克隆。

产品特点：

√ 无需测序，4小时可完成检测，快速确定是否发生了正确的基因敲入

√ 无需特殊仪器，使用荧光读板机或者定量PCR仪进行测定

√ 可用于批量或者单克隆细胞检测

√ SNP分析理想选择，双色检测可同时检测两个不同等位基因（SNP和WT等）

实验案例：鉴定iPSC基因编辑（SNP/WT）杂合克隆细胞系

Justin McDonough博士比较了Guide-it Knockin Screening Kit与Sanger测序在鉴定iPSC基因编辑（SNP/WT）杂合克隆细胞系实验的分析结果。

上图X轴为通过Sanger测序得到的基因分型(WT：野生型；SNP：HDR；Indel，NHEJ；unknown：未知)。同时使用Guide-it Knockin Screening Kit测定，检测出克隆细胞中携带的经编辑（SNP）和未经编辑（野生型WT）等位基因分别以蓝色（绿色荧光）和紫色（红色荧光）荧光信号强度表示。在大多数情况下，Knockin Screening Kit的分析结果与Sanger测序的分析结果是一致的（例如杂合克隆A07），但一些例子表明，使用常用的生物信息学分析工具会出现遗漏或者错误识别的情况。例如，像F04这样携带SNP的细胞克隆并没有通过Sanger测序数据的分析被识别出来（F04，上图中被定义为“unknown”）。此外，另一个携带所需SNP（E07）的克隆被错误地认为是在靶位点编码两个indel等位基因拷贝。研究人员表示，Knockin Screening Kit非常善于识别WT/SNP杂合克隆，这正是实验非常需要的。

3、基因编辑后高通量SNP筛选

用途：快速检测基因编辑后细胞群中的单核苷酸替换、SNP基因分型。

产品特点：

√ 高通量SNP筛选，无需测序，4小时即可快速完成

√ 可检测任意基因位点核苷酸替换

√ 无论是哪种合子型，都可以识别出基因编辑后的细胞克隆

实验案例：利用Guide-it SNP Screening Kit在多个人类基因组位点检测核苷酸替换

以野生型或者纯合型的基因组DNA（从Coriell研究所获取）为样品，使用Guide-it SNP Screening Kit分析标明碱基替换。结果显示，与野生型（橙色）和阴性对照（灰色）样品所产生的荧光信号相比，发生了碱基替换的纯合型（蓝色）样品产生了更强的荧光信号，表明实验成功检测到了基因组中所有碱基替换。

4、基因编辑后基因组序列确认

用途：确认CRISPR/Cas9等多种方式基因编辑后产生的序列插入或序列缺失。

产品特点：

√ 确认CRISPR/Cas9等多种方式基因编辑后导入的突变位点基因序列

√ 以细胞裂解液为起始的PCR与In-Fusion无缝定向基因克隆技术相结合，简便、快速且有效地获得目的克隆

√ ALL-IN-ONE型试剂盒，包含实验所需的目的基因扩增、克隆、制备测序用样品所需的全部试剂

实验案例：CRISPR/Cas9基因编辑后，确认CD81基因插入、缺失序列

转染表达Cas9和作用于CD81基因的sgRNA至HeLa细胞进行基因编辑，采用Guide-it Indel Identification Kit制备CD81基因靶位点测序用样品。选择6个克隆进行测序并将测序数据与野生型基因序列进行比对，确认CD81基因通过基因编辑导入的基因位点插入/缺失。

5、基因编辑后克隆基因型确认

用途：确认CRISPR/Cas9等多种方式基因编辑后单/双等位基因突变。

产品特点：

√ 通过Cas9-sgRNA体外剪切实验确定单/双等位基因突变类型

√ 产品包括用于体外剪切实验的高纯度的重组Cas9核酸酶

√ 操作步骤流程化，可使用来自于细胞的目的基因组DNA直接扩增

实验案例：测定HEK 293细胞中的基因型

图A：使用Cas9和靶向C4BPB基因的sgRNA对HEK 293细胞进行基因编辑。使用Guide-it Genotype Confirmation Kit对已获得的15个单细胞克隆进行C4BPB位点的基因型鉴定。图中左侧的野生型 (WT)，单等位基因 (M)，双等位基因 (B)在分析中作为对照。结果表明,克隆1，4，10，12是野生型；克隆2是单等位基因突变；克隆3，5-9，11和13-15是双等位基因突变。 图B：对A图中挑选的克隆进行测序分析。每个结果中，小写字母代表的是野生型（WT）序列。对在A图中使用基因型鉴定方法确认结果为双等位基因突变的克隆，进一步测序分析表明克隆7是杂合子，克隆9和11是纯合子。在克隆2中，检测到3种不同的等位基因，可能是因为在HEK 293细胞系中出现拷贝数变异。

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Takara有来源于野生型酿脓链球菌的重组Cas9蛋白质，助力基因编辑，锚定靶点切割！Guide-it Recombinant Cas9有多种蛋白质浓度产品，可满足电穿孔、显微注射等多种不同复合物导入方式。C末端的NLS核定位信号可以实现快速有效的突变导入，且经过不断的产品优化，已证实对哺乳动物细胞具有良好的耐受性，可降低导入哺乳动物细胞时所造成的细胞损伤，使脱靶效应更小化的同时，更容易实现高效率的基因编辑。

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