复旦大学王永明课题组开发出精准性高的Cas9基因编辑工具

　　

复旦大学王永明课题组开发出精准性高的Cas9基因编辑工具

RNA引导的CRISPR-Cas9系统被广泛应用于哺乳动物细胞的基因组编辑，在基因遗传病的治疗中展现出巨大的发展潜力。限制基因编辑工具应用的主要因素包括编辑活性、PAM限制、蛋白大小、特异性问题等。识别NGG PAM的SpCas9编辑活性高，是最常用的基因编辑工具。但SpCas9特异性较差，使用时往往伴随大量的有害突变。且当SpCas9用于基因治疗时，SpCas9太大无法被单个AAV递送。SaCas9虽然可以被单个AAV递送，但是向位点受复杂NNGRRT PAM的限制，编辑范围小。因此，为了实现基因治疗目的，可被单个AAV包装且更加全面的CRISPR/Cas系统的开发成为基因编辑领域亟待解决的重要问题。

图1. Cas9活性鉴定思路

复旦大学王永明课题组致力于开发新型CRISPR/Cas9系统，扩大基因编辑范围。为此设计了Cas9蛋白的鉴定新思路，将基因编辑和GFP表达偶联，实现对CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中的快速筛选（图1）。团队先后对300多个Cas9进行鉴定，开发出一系列性能优异的核酸工具酶。该课题组于2020年3月开发出SauriCas9，识别NNGG PAM，蛋白较小，可被单个AAV包装，扩大了基因编辑范围。2021年4月团队开发出SlugCas9-HF，蛋白小、特异性高，活性可以和SpCas9媲美。2021年12月，该课题组开发出SchCas9，识别更简单的NNGR（R=A or G） PAM，编辑范围得到进一步扩大。2022年8月，课题组开发出II类C型Nsp2Cas9及其嵌合体核酸酶，识别N₄C PAM，进一步大幅扩展了基因组编辑范围。

2023年2月3日，王永明课题组又有新突破，在Molecular Therapy上在线发表了题为“Genome editing with natural and engineered CjCas9 orthologs”的研究论文。

作者通过对CjCas9同源蛋白的筛选，鉴定到3种天然的基因编辑工具（Hsp1Cas9、Hsp2Cas9、CcuCas9），其PAM分别为N₄RAA、 N₄CC和N₄CNA，扩大了基因编辑应用范围（图2）。

图2.CjCas9同源编辑工具的鉴定

为获得综合性质更优的编辑工具，作者以活性较高的Hsp1Cas9为骨架，与Hsp2Cas9的PI结构域嵌合，获得识别PAM为N₄C和N₄T的Hsp1-Hsp2Cas9（图3）。

图3. Hsp1-Hsp2Cas9嵌合体编辑工具的开发

作者根据CjCas9晶体结构信息进行合理设计，得到了Hsp1-Hsp2Cas9-Y突变体，在不降低编辑活性的同时提高了精确性，为临床基因治疗应用提供了更加安全的编辑工具(图4)。

图4. Hsp1-Hsp2Cas9-Y的特异性分析

高思琪、王瑶、齐涛为论文的共同一作，复旦大学王永明、孙淑娜、华林中心的刘慧慧是论文的共同通讯作者。

论文DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.01.029