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实时读取RNA结构的新染色方法
【字体: 大 中 小 】 时间:2023年02月06日 来源:Nucleic Acids Research
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一种新的显微技术可以实时研究活细胞中的RNA G-四重链,这对对抗肌萎缩性侧索硬化症具有重要意义。
与RNA结合的菁染料(Alexa Fluor 647,粉红色星星)的荧光闪烁取决于RNA的结构。当RNA像发夹一样折叠时,荧光闪烁是快速的,当RNA切换到G-四重链时,闪烁是缓慢的(Akira Kitamura)。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS),俗称卢伽雷氏病和斯蒂芬霍金病,是一种神经退行性疾病,导致身体肌肉逐渐失去控制。目前该病是无法治愈的,90%以上的病例病因不明——尽管遗传和环境因素都被认为与之有关。
北海道大学高级生命科学学院的Akira Kitamura博士和瑞典KTH皇家理工学院的Jerker Widengren教授的研究小组开发了一种新技术,能够实时检测活细胞中RNA的特征结构。这项基于荧光显微光谱的技术,发表在Nucleic Acids Research。
该研究的第一作者Kitamura解释说:“人们认为与ALS发展有关的遗传因素之一是一种特定的RNA序列,它形成了一种四链结构,称为G-四重链结构。通常情况下,这些结构调节基因的表达。然而,人类9号染色体的突变会导致G四重链的形成,这可能在包括ALS在内的神经退行性疾病中发挥作用。”
了解G-四重链在疾病中的确切作用的最大障碍之一是实时研究它们在活细胞中的形成和位置的局限性。Kitamura和Widengren小组成功地开发了一种简单、可靠且广泛适用的技术,解决了现有的问题。
这项技术追踪的是一种名为Alexa Fluor 647 (AF647)的菁染料。当标记为RNA时,染料的荧光闪烁状态随着RNA G-四重链的形成而改变。研究小组使用一种称为TRAST(瞬态)监测的显微镜技术分析了AF647标记的RNA,以实时检测这种荧光闪烁。
Kitamura在描述这项技术时说:“从视觉上看,荧光强度的时间分辨变化就像闪烁一样。”“在TRAST中,我们将细胞暴露在变化的光强度的特定模式下,并测量细胞中RNA结合染料在特定时间间隔内发出的平均荧光强度。通过测量眨眼特性的变化,我们可以区分细胞内RNA的结构。”
研究小组在实验室条件下校准了他们的实验,准确地确定了荧光闪烁对应的RNA G-四重链。从这些数据中,他们能够使用TRAST确定活细胞中RNA G-四重链的位置。
这项工作证明,在活细胞中,甚至在单细胞中,花菁染料可以提供RNA G-四重链折叠状态的敏感读出参数。这反过来又使得在细胞内水平上实时研究疾病中的RNA G-四重链复合物成为可能。它还可以应用于研究细胞中蛋白质的折叠和错误折叠。
Trans-cis isomerization kinetics of cyanine dyes reports on the folding states of exogeneous RNA G-quadruplexes in live cells