王应祥团队破解减数分裂交叉干涉的分子机制

　　

减数分裂是真核生物有性生殖所必需，同源染色体间重组是减数分裂的核心事件，既保证了基因组的稳定性又产生了后代的遗传多样性。根据经典的DNA双链断裂（Double strand break，DSB）修复模型，重组起始于程序化产生的DSBs，断裂的DSB末端进一步切割形成3′单链DNA（single strand DNA, ssDNA），然后RPA（Replication protein A）结合ssDNA防止其降解，RPA接下来被重组酶RAD51和DMC1取代，形成由RAD51/DMC1包裹的螺旋状单链核蛋白纤维，寻找同源染色体的同源序列进行配对，入侵形成重组中间体D-loop和随后的double Holliday Junction（dHJ），重组中间体解开产生同源染色体间的交换（Crossover，CO）和非交换。

在大部分生物中，CO在染色体上非随机分布。19世纪20年代，Sturtevant和Muller研究果蝇减数分裂发现染色体上紧密相邻CO的数目远低于预测的数量，并且CO之间的距离也比随机分布更均匀，暗示存在影响CO形成和分布的潜在机制。1915年，Sturtevant首次将这一现象命名为“交叉干涉”（Crossover interference），指的是一个CO的产生会抑制染色体上相邻位置形成另一个CO的现象（Sturtevant A H. Zeitschrift für induktive Abstammungs-und Vererbungslehre, 1915, DOI: 10.1007/BF01792906）。然后，100多年来，虽然人们发现了多个蛋白参与这个过程，但是其作用的具体机制一直悬而未决。

随着对减数分裂过程的进一步认知，研究发现真核生物减数分裂普遍产生两类CO：干涉敏感型（I型）和干涉不敏感型（II型），其在染色体上的数目和分布受到严格的调控。已报到的大部分生物减数分裂产生的主要是I型CO，受到一类保守的ZMM蛋白（Zip1、Zip2、Zip3、Zip4、Msh4、Msh5和Mer3）及MLH1/3调控。植物HEI10是酵母Zip3的同源蛋白，其突变导致I型CO缺失。因其可以特异地在I型CO形成的位置定位，也被作为动植物中I型CO的主要标志物。小鼠和拟南芥中的证据都表明HEI10的量与I型CO的数目正相关，其作用机制不清楚。HEI10蛋白质最显著的结构特征是具有N端保守的RING结构域，可能作为E3泛素连接酶发挥功能，但其直接的底物也仍然不清楚。

基于ZMM蛋白HEI10具有在CO位置聚集的特征，本研究首次通过实验在体内和体外证明了HEI10蛋白质具有发生液液相分离（Liquid-liquid phase separation，LLPS）的特性，该生化特性依赖于第70位丝氨酸（Ser）。Ser70点突变后与hei10 T-DNA插入的突变体表型一致，我们证明了该点突变可能通过影响蛋白质结构从而导致HEI10无法发生相分离。有趣的是，在烟草中共表达HEI10和其他I型CO蛋白的时候，我们观察到了HEI10可以促进其他I型CO蛋白形成点状的共定位信号，反之其他I型CO对于HEI10蛋白质的聚集也有部分促进作用。但是这种相互促进现象并没有在HEI10和II型CO蛋白之间发生。这就暗示了在减数分裂CO形成的过程中，I型CO相关的蛋白质很可能是通过相分离的机制共同聚集于CO发生的位置，以促进I型CO的形成（图1）。利用这一机制，可以很好地解释“交叉干涉”现象，即相分离过程中小的蛋白质液滴逐渐融合成大的condensate，相邻区域几乎不会出现两个CO。这和近期的细胞学研究有异曲同工之妙，研究者通过超分辨率显微镜观察发现，HEI10蛋白在早期减数分裂染色体上由密集的小点逐渐聚集，随着减数分裂进程，最终形成只定位在I型CO位置的大的点状信号，该研究结合数学模型计算分析提出了HEI10在染色体上逐渐聚集的“粗化模型”。

此外，本研究还证明了拟南芥HEI10的E3泛素连接酶活性，并筛选到了其底物ssDNA结合蛋白RPA1a，并揭示了HEI10的相分离对于RPA1a的泛素化降解具有促进作用。

图1：相分离调控减数分裂干涉敏感型CO形成的模型

综上所述，本研究首次揭示了重组蛋白的相变机制，支持了前人对交叉干涉提出的“粗化模型”，为一个多世纪前发现的交叉干涉现象提供了合理解释。由于HEI10以及ZMM蛋白质在物种中的保守性，我们推测这一机制在真核生物中也是保守存在的，这对于进一步深入理解减数分裂重组形成过程有着十分重要的意义。

复旦大学生命科学学院博士生王天一为文章的第一作者，复旦大学/岭南现代农业生物与技术广东省实验室/华南农业大学王应祥教授，华南农业大学王聪教授，美国北卡罗来纳大学教堂山分校Gregory Copenhaver教授为共同通讯作者。华南农业大学尤辰江教授和贾倩副教授也提供了指导和帮助，复旦大学已毕业的王宏宽和连启超博士也参与了该项工作。该研究得到了国家自然科学杰出青年基金、复旦大学遗传工程国家重点实验室、岭南现代农业生物与技术广东省实验室和华南农业大学“双一流”建设经费的资助。