整合UMI小鼠TCR profiling：SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)

免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定时间，个体的循环系统内所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。

T细胞是获得性免疫反应的重要组成部分，其表面受体蛋白（T cell receptors, TCRs）发挥着识别抗原分子的作用。NGS是解析TCR多样性的主流技术，对揭示个体获得性免疫反应的奥秘提供了宝贵的技术支撑。

SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)是一款具有高灵敏度和低偏差的小鼠TCR NGS文库构建试剂盒。该试剂盒整合SMART（Switching Mechanism at 5' end of RNA Template）全长cDNA合成技术与5’RACE技术，可捕获TRA和TRB基因完整的V(D)J可变区，用于后续NGS分析。

该试剂盒支持使用不同input量的RNA（RIN＞7）或细胞起始，均可获得高品质的测序文库，如小鼠脾脏或T细胞来源 total RNA(1 ng-1 μg)，以及全血、骨髓、胸腺来源total RNA(10 ng -1 ug)，或纯化后完整的T细胞(1,000-10,000个)。文库中可同时包含α链和β链的多样性信息。

同时，该试剂盒包含UMI（Unique Molecular Identifier），用以去除PCR偏差及测序错误所产生的reads，提供更正确和可靠的结果。

搭配使用UDI（Unique Dual Indexs），最多可支持384个样本同时测序。

特别开发的Cogent NGS Immune Profiler Software (Cogent IP)，能直接对Illumina测序仪的下机数据进行高品质的TCR profiling分析，包括克隆型的鉴定与计数、V(D)J区域的序列分析。另外，基于云的Cogent NGS Immune Viewer，能可视化的展示TCR数据，使用Cogent IP输出文件，可以轻松生成可供发布的图表结果。

下面就详细了解一下它的特点吧！

图1 SMART-Seq Mouse TCR(with UMIs)技术流程

图2 评估试剂盒在不同样本起始量和样本类型中的性能表现 

Panel A. 分别对10，100，250，500和1,000 ng小鼠脾脏来源 RNA使用SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)制备了TRA (蓝色) 和TRB (紫色) 文库，然后在Illumina NextSeq测序（PE 150），测序reads downsampled至1.5×10⁷。结果显示，随着起始量的增加，检测到的克隆型数量也随之增加。

Panel B. 分别对四种不同样品类型的小鼠RNA（200 ng RNA）使用SMART-Seq Mouse TCR制备文库。然后在Illumina NextSeq测序（PE 150），测序reads downsampled至2.5×10⁷。测序结果表明，TCR序列在这些样品类型中都被灵敏地检测到，这表明该试剂盒非常适合用于小鼠TCR的分析。

图3 使用UMIs校正PCR重复和测序错误

Panel A. 对10 ng小鼠脾脏来源 RNA使用SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)制备TRA和TRB文库。其中蓝线和紫线分别是指经过UMI修正误差和和没有经过UMI修正误差的数据。

Panel B. 为了评估SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)的再现性，使用该试剂盒分别对10 ng和100 ng小鼠脾RNA起始样本构建TCR文库。然后在Illumina MiSeq测序。维恩图显示分别使用300 cycles和600 cycles测序时，两者之间至少有87%的克隆型重叠，表明该试剂盒卓越的再现性。

图4 评估试剂盒的测序灵活性 

为了评估该试剂盒是否支持全长V (D) J或CDR3序列，使用该试剂盒分别对10 ng和100 ng小鼠脾脏RNA起始样本构建TCR文库。然后在Illumina MiSeq测序平台使用300 cycles和600 cycles进行测序。测序read downsampled 至1×10⁶。使用Takara Bio Cogent NGS Immune Profiler软件处理数据。