科研前沿 | In-Cell Western 高通量抗癌药物筛选新利器！

【字体：大中小】 时间：2023年11月08日 来源：基因有限公司

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　　在本篇文章中，作者通过LI-COR Odyssey®近红外激光成像系统开发了In-Cell Western™测定法，将其作为一个快速、准确、高通量的平台，用于筛选ORF1p表达抑制剂。

简介

In-Cell Western™（ICW）是由LI-COR Biosciences公司开发的一种直接在微孔板内（96/384孔板）对细胞内目标蛋白进行定量免疫荧光检测的方法。无需进行裂解、制胶、电泳、转膜等步骤，微孔板内的细胞只需经过固定、透化、一抗、二抗孵育、洗涤等步骤后进行微孔板扫描成像，即可实现对细胞内目标蛋白的精确定量。In-Cell Western™快速，精确，高效的特性是高通量筛选的杰出工具。该技术加速新药物的发现，让我们更好地理解基因表达。这将在未来为疾病治疗开辟新的可能性。

研究背景

长散布核元件1（LINE-1）是人类基因组中的显性自主逆转录转座子，在影响体细胞基因组的结构和功能中发挥作用。LINE-1编码的ORF1p蛋白可在多种肿瘤中检测到，其过度表达被认为是组织侵袭性癌症的标志。在本篇文章中，作者通过LI-COR Odyssey®近红外激光成像系统开发了In-Cell Western™测定法，将其作为一个快速、准确、高通量的平台，用于筛选ORF1p表达抑制剂。相关研究《A High Throughput Cell-Based Screen Assay for LINE-1 ORF1p Expression Inhibitors Using the In-Cell Western Technique》于2022年发表在Frontiers in Pharmacology。

部分结果展示

1. 建立基于In-Cell Western™的ORF1p表达抑制剂筛选试验

为了开发Odyssey® In-Cell Western™筛选系统，需要寻找具有高ORF1p表达水平的细胞系。通过Western Blot和免疫荧光确定人乳腺癌细胞(MCF7)、人乳腺管癌细胞(T-47D)和人前列腺癌细胞(LNCaP)的ORF1p表达水平高于其他细胞系(图1A,B)。随后作者使用Western Blot和In-Cell Western™在LI-COR Odyssey®近红外激光成像系统上评估ORF1p抑制剂IFN-α在T-47D细胞中的ORF1p抑制水平。对比基于膜的Western Blot，In-Cell Western™在原位细胞免疫荧光检测中显示了更为显著的结果，随着IFNα17浓度增加对ORF1p的抑制效果呈现出递增的趋势（图1D,E）。结果确定In-Cell Western™是一种准确、高效的ORF1p 表达抑制剂筛选方法。

图1. 建立基于In-Cell Western™的ORF1p抑制剂筛选试验。(A). MCF7、T-47D、PC-3、A549、HeLa 和 LNCaP 六种癌细胞系的ORF1p表达的Western Blot分析，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为阴性对照。(B).六种癌细胞系中ORF1p 表达的免疫荧光测定。(C).Western Blot 分析评估IFNα17和d4T对T-47D细胞中的ORF1p的抑制活性。(D).用递增剂量的IFNα17（50、100、200和500U）处理T-47D细胞，通过Western Blot分析检测ORF1p的表达水平。(E).用剂量递增的IFNα17处理后，In-Cell Western™测定分析T-47D细胞中ORF1p表达水平。Western Blot 和In-Cell Western™检测结果中的绿色荧光（ORF1p表达水平）和红色荧光（β-actin表达水平）分别为LI-COR Odyssey® 近红外激光成像系统800nm和680nm通道的成像结果。

2. 基于In-Cell Western™高通量筛选的Z'因子测定

Z'因子是高通量筛选实验评估和验证中使用最广泛的参数。作者评估了In-Cell Western™测定的关键性能参数，确定其性能和稳定性。该测定的 Z'因子为 0.55，表明In-Cell Western™是一种优异的高通量筛选方法。

图2. 将半板的T-47D 细胞和IFNα17(200U/ml)或作为载体对照的 PBS 一起孵育 48 小时，使用LI-COR Odyssey®近红外激光成像系统扫描孔板，计算荧光强度和Z'因子。

3. 使用In-Cell Western™检测筛选天然化合物库结果

作者使用In-Cell Western™方法在LI-COR Odyssey®近红外激光成像系统中筛选了 Target Mol 和Selleckchem 天然化合物库，总共包含 1947 种化合物。与DMSO对照相比，其中 3 个化合物，#1(羟基孕酮)、#2(2,2':5′,2″-三噻吩)和 #3(乙炔雌二醇)显示出超过一倍的抑制活性（图3A）。随后作者通过Western Blot验证了三种化合物对ORF1p 的抑制活性（图3B）。

图3. In-Cell Western™方法对抑制ORF1p表达的天然化合物筛选结果及验证。(A).天然化合物筛选结果。所有化合物添加量均为每孔10 μM。(B)用不同浓度的#1、#2和#3处理T-47D细胞，48小时后，通过Western Blot检测ORF1p表达水平。

研究结论

文章结果表明，由In-Cell Western™技术筛选出的ORF1p表达抑制剂可抑制多种癌细胞的增殖。In-Cell Western™可以作为一种高效、经济、准确的高通量筛选方法，用于寻找抑制ORF1p 表达或LINE-1转座子的新分子。

In-Cell Western™优势

 技术优势

准确：固定保留翻译后修饰。原位检测体现有细胞环境的真实结果。近红外激光扫描成像。

高效：可同时检测多个蛋白表达。比Western Blot更省时，实验重复性更高。

经济：所需细胞更少，接种不等量细胞也可准确定量。所需更少试剂和缓冲液，一抗可重复使用。细胞可用于后续处理。

高通量：使用96孔板/384孔板试验和检测。

 应用优势

In-Cell Western™具有广泛的应用领域，包括药物筛选、细胞信号通路研究、病毒感染研究、疾病研究、药物治疗效果评估以及基础细胞生物学研究等诸多领域。更重要的是，它还是美国药典官方推荐的胰岛素检测技术。这种多功能性和权威认可，使In-Cell Western™成为了现代生物医学研究和药物开发中的不可或缺的工具。

Odyssey®的丰富应用

LI-COR Biosciences公司的Odyssey® 红外激光成像系统可以实现定量Western Blot检测，具有重复性好、定量准确、多色荧光成像、背景低、灵敏度高、可直接检测、应用范围广等多种优势，其不仅可以进行孔板的In-Cell Western™检测，还可以实现近红外荧光Western Blot、可见荧光Western Blot 、组织切片成像、On-Cell Western、EMSA/凝胶迁移实验、荧光蛋白质芯片、荧光核酸芯片、考染胶成像、器官成像等多种应用。