类器官的3D成像：你需要知道的一些小技巧

类器官培养彻底改变了科学研究，为体外模拟复杂的哺乳动物组织提供了一种全新的方法。然而，在使用常规技术来表征类器官时，人们却面临着通量低、信息深度不够等挑战。

类器官（organoids）培养彻底改变了科学研究，为体外模拟复杂的哺乳动物组织提供了一种全新的方法。然而，在使用常规技术来表征类器官时，研究人员却面临着通量低、信息深度不够等挑战。在此，我们将介绍一些为解决这些挑战而开发的新型系统，并分享对类器官培养物进行3D成像的小技巧。

常规方法的局限性

Molecular Devices公司的高级科学家Oksana Sirenko博士称：“在类器官培养刚刚建立时，人们通常会对样本进行石蜡包埋和切片，然后对各种组织特异性标志物和干细胞标志物进行免疫染色，并用传统的显微镜观察类器官。”

“此外，他们还采用转录组分析来监测不同时间的类器官分化。尽管这些方法信息量大，但速度太慢，需要大量劳力，无法用于化合物筛选或药物开发。因此，检测类器官形态和功能变化的高通量分析方法开始发展起来。现在，为了更好地捕捉类器官培养物中的深度信息，研究人员正在使用自动化的高内涵成像平台等技术。”

成像上的挑战

与单层细胞或组织切片的2D成像相比，类器官培养物的3D成像面临多重挑战。据安捷伦科技公司全球科学项目经理Joe Clayton介绍，首先，类器官的厚度和不透明性会限制光线穿透，因而难以用传统的显微镜技术来捕捉内层的详细信息。其次，类器官的动态特性需要使用延时成像，但这会导致光毒性和光漂白。

“在成像过程中维持类器官的结构完整性是另一个令人担忧的问题。此外，3D成像产生的大量数据很快就会超出数据存储设备的容量和计算设备的负荷。为了应对这些挑战，往往需要将先进的显微镜技术、专门的成像设备和创新的数据分析方法结合起来，才能获得有意义的数据，”Clayton补充说。

另一个让人头疼的问题是如何在成像过程中维持生物体的自然行为。Etaluma公司首席执行官Chris Shumate指出：“类器官培养物的长期生长需要更换培养基，因此常规的孵育小室不大适用。解决这个问题的方法之一是将整台显微镜放置在细胞培养箱内。这样就可以在培养环境下补充和更换培养基，确保在数天或数周的延时实验中始终保持生理状态。”

最新的技术进展

类器官研究领域的许多最新成果都归功于仪器设备的进步，其中包括共聚焦技术以及水浸物镜和激光器的使用。“共聚焦系统通常会采用带有微孔的转盘，可在成像过程中显著减少焦外区域的光散射，” Sirenko博士谈道。

“虽然这种方法会导致光强度降低，因为只有一部分光穿过小孔，但使用激光器等强光源可抵消这个问题，从而实现高分辨率成像。水浸法可进一步提高成像质量、强度和分辨率。”

此外，与传统的手动方法相比，微孔板形式的自动成像方法在通量和重复性方面带来了很大改进。Clayton指出，安捷伦最近推出的BioTek Cytation C10共聚焦成像检测系统正是基于这一策略。这个系统结合了转盘式共聚焦和宽场成像以及微孔板检测系统，扩大了应用范围。

“Cytation C10的多个功能是为类器官培养物的3D成像而设计的，包括先进的成像特性，比如自动对焦和自动ROI鉴定，可以捕获感兴趣的特定区域，而多通道Z轴叠加成像与Gen5软件相结合，能够直观地观察整个类器官样本，”他说。“此外，Cytation C10还可以与Agilent BioTek BioSpa全自动培养箱整合，实现长期的活细胞成像。”

图像分析的改进也是研究人员深入分析类器官培养物所必需的。Molecular Devices的MetaXpress® 高内涵图像采集与分析软件能够进行复杂的测量，比如类器官内的细胞计数和表征、亚细胞对象分析、邻近度和聚类检测，而IN Carta®人工智能分析软件可利用机器学习工具来识别不同的对象类型并区分不同的形态或特征。

此外，业界也开发出各种试剂来增强类器官培养物的3D成像，包括让组织变得透明的产品，如Corning® 3D Clear组织透明化试剂。Corning Life Sciences公司高级应用科学家Hilary Sherman解释说：“透明化试剂将整个组织内的折射率均一化，从而减少光散射，并提高光的穿透力。”这种试剂支持3D细胞培养模型的成像和基于培养板的高通量处理。

3D成像的小技巧

研究人员可以通过多个步骤来确保类器官培养物的3D成像取得成功。“与任何成像实验一样，优化实验方案非常重要，”Sherman谈道。“有时，对于像类器官这样比较大的3D结构，抗体和染料的渗透可能都挺难的，因此测试不同的浓度、透化技术和孵育时间相当重要。”

“你不妨考虑一下专为荧光成像应用而设计的生长培养基或缓冲液，可减少背景或自发荧光，” Clayton补充说。“此外，一定要选择激发和发射光谱与成像系统完全匹配的荧光标签。如果可行的话，加入基因编码的荧光标签，可使整个类器官的标记更加一致。”

Sirenko则建议一开始在低倍率下观察各个孔，然后再以高倍率对类器官进行成像。“对于基本计数和观察，建议使用较低的倍率，如4X，”她说。“10X为视野内的类器官分析提供了足够的分辨率。若要显示更多的细节，则需要20X和40X等更高的倍率，不过这可能需要拼接不同的图像才能捕捉整个物体。”